TNBC中Fn14表达及临床相关性分析
验证Fn14在TNBC中的过表达及其与患者生存的关系
分析TCGA BRCA RNA-seq数据集、TNBC患者肿瘤及配对正常组织的Western blot、乳腺癌细胞系Western blot及生存分析
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TWEAK/Fn14信号驱动的超级增强子重编程促进三阴性乳腺癌的促转移代谢重塑
TWEAK/Fn14 signalling driven super-enhancer reprogramming promotes pro-metastatic metabolic rewiring in triple-negative breast cancer.
实验完整度
高包含细胞系、患者样本、小鼠异种移植模型及转录组、表观组、染色质互作等多层验证
主要模型
TNBC细胞系（MDA-MB-231、Hs578T、BT549） HER2阳性及ER阳性乳腺癌细胞系 TNBC患者肿瘤及配对正常组织 小鼠原位异种移植模型（MDA-MB-231、4T1）
重点核对
TWEAK处理浓度：TNBC和HER2细胞系10 ng/ml，ER阳性细胞系30 ng/ml T5224体外浓度10 µM，体内口服150 mg/kg，每周三次 小鼠原位注射细胞数：MDA-MB-231为5×10^5，MCF7为1×10^6，4T1为3×10^5 NAMPT增强子#3的1 KB缺失通过CRISPR-Cas9实现 体外实验3个生物学重复，体内实验5个生物学重复
摘要
三阴性乳腺癌（TNBC）是侵袭性最强的乳腺癌亚型，靶向治疗选择有限。近期有报道将成纤维细胞生长因子诱导型14（Fn14）受体在雌激素受体（ER）阴性乳腺癌中的过表达与转移事件相关联，在此基础上，我们发现Fn14在TNBC患者中特异性过表达，并与不良生存相关。我们证明，组成性Fn14信号重连TNBC的转录组和表观基因组景观，导致肿瘤生长和转移增强。我们进一步阐明，此类机制激活TNBC特异性超级增强子（SE），通过染色质环化驱动癌症依赖基因的转录激活。特别地，我们揭示了SE驱动的烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）上调，其促进NAD+和ATP代谢重编程，这对丝状伪足形成和转移至关重要。总体而言，我们的研究详细阐述了TWEAK/Fn14信号与TNBC转移之间复杂的机制联系，揭示了若干可用于TNBC患者靶向治疗的脆弱点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TWEAK/Fn14信号是否以及如何通过表观遗传重编程调控TNBC的转录组和代谢，从而促进肿瘤进展和转移。
- 核心机制
- 组成性TWEAK/Fn14信号激活TNBC特异性超级增强子，通过染色质环化上调NAMPT表达，进而重编程NAD+和ATP代谢，促进丝状伪足形成和转移。
- 主要证据
- TNBC细胞系和患者样本的转录组、ATAC-seq、H3K27ac ChIP-seq和HiChIP分析；NAMPT增强子#3缺失和NAMPT敲低实验；小鼠原位异种移植模型的肿瘤生长和转移评估。
- 研究意义
- 揭示了TWEAK/Fn14信号在TNBC表观基因组重编程中的先前未知作用，为TNBC靶向治疗提供了潜在脆弱点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TWEAK/Fn14对TNBC细胞功能及体内肿瘤进展的影响
验证TWEAK/Fn14信号是否驱动TNBC的增殖、侵袭和转移
Transwell侵袭实验、增殖实验、CRISPR敲除Fn14、小鼠原位异种移植及IVIS成像
TWEAK/Fn14调控的转录组和表观基因组分析
解析TWEAK/Fn14信号对TNBC转录组和染色质景观的影响
RNA-seq、ATAC-seq、H3K27ac ChIP-seq及生物信息学分析
超级增强子-启动子染色质互作分析
确定TWEAK/Fn14激活的超级增强子是否通过染色质环化调控癌症依赖基因
H3K27ac HiChIP在MDA-MB-231细胞中进行，整合增强子和基因表达数据
NAMPT增强子#3的功能验证
验证TNBC特异性超级增强子对NAMPT表达及肿瘤恶性行为的调控
CRISPR-Cas9介导的增强子#3缺失、NAMPT敲低、侵袭实验、小鼠原位异种移植
NAD+和ATP代谢及丝状伪足形成分析
探究NAMPT介导的代谢重编程对丝状伪足和侵袭的影响
NAD+/NADH和ATP检测、丝状伪足染色及定量、Lat A处理回复实验
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证表观遗传和染色质变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | HyClone | -- | |
| 胎牛血清 | Sigma | -- | |
| 支原体PCR检测试剂盒 | Applied Biological Materials Inc | G238 | |
| 药物处理 | 重组人TWEAK | PeproTech | 310-06 |
| T5224 | MedChemExpress | HY-12270 | |
| 质粒构建 | TLCV2 | Addgene | 87360 |
| lentiCRISPR v2 | Addgene | 52961 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | |
| pLKO.1 | Addgene | 10878 | |
| pLJM1-EGFP | Addgene | 19319 | |
| pLenti CMV V5-LUC Blast | Addgene | 21474 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| cOmplete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 5056489001 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | 10708984001 | |
| TissueRuptor II组织破碎仪 | Qiagen | -- | |
| Bradford法蛋白定量染料 | Bio-Rad | 5000006 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | 23225 | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | 1620177 | |
| 抗NFκB2抗体 | Cell Signalling | 3017 | |
| 抗NF-κB p65抗体 | Cell Signalling | 8242 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Cell Signalling | 4668 | |
| 抗JNK抗体 | Santa Cruz | 7345 | |
| 抗磷酸化p44/p42 (ERK1/2)抗体 | Cell Signalling | 4370 | |
| 抗p44/p42 (ERK1/2)抗体 | Cell Signalling | 9107 | |
| 抗Fn14抗体 | Abcam | 109365 | |
| 抗PBEF (NAMPT)抗体 | Santa Cruz | 393444 | |
| 抗MAFG抗体 | Santa Cruz | 166548 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz | 32233 | |
| 抗兔二抗 | Cell Signalling | 7074 | |
| 抗鼠二抗 | Santa Cruz | 516102 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 侵袭实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| Matrigel基质胶 | Corning | -- | |
| optiMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 代谢检测 | NAD/NADH-Glo检测试剂盒 | Promega | G9071 |
| CellTiter-Glo 2.0检测试剂盒 | Promega | G9241 | |
| 丝状伪足染色 | Alexa Fluor™ 488鬼笔环肽 | Invitrogen | 12,379 |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂（含DAPI） | Invitrogen | P36914 | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| TURBO DNA-free试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| Agilent RNA 6000试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA磁性分离模块 | NEB | E7490 | |
| NEBNext® Ultra™ II定向RNA文库构建试剂盒（Illumina） | NEB | E7760 | |
| ChIP-seq | 抗乙酰化组蛋白H3 (Lys27)抗体 | Sigma | 07-360 |
| 抗MAFG抗体 | GeneTex | GTX114541 | |
| Protein G Sepharose琼脂糖珠 | GE Healthcare | -- | |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| ChIP-qPCR | SsoAdvanced Universal SYBR预混液 | Bio-rad | 1725272 |
| ChIP-seq | NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 | NEB | E7645 |
| Agilent高灵敏度DNA试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| KAPA文库定量试剂盒 | Roche | KK4824 | |
| ATAC-seq | DNA清洁浓缩试剂盒 | Zymo | -- |
| Nextera DNA CD索引 | Illumina | -- | |
| NEBNext Ultra II Q5预混液 | NEB | -- | |
| AMPure XP试剂 | Beckman Coulter | -- | |
| 动物实验 | D-荧光素 | GoldBio | -- |
| IVIS活体成像系统 | Perkin Elmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TWEAK处理 | TWEAK处理浓度：TNBC和HER2细胞系10 ng/ml，ER阳性细胞系30 ng/ml 阅读提示：Methods中Cell lines and reagents小节 |
| AP-1抑制剂处理 | T5224体外浓度10 µM，体内口服150 mg/kg，每周三次 阅读提示：Methods中Cell lines and reagents及Mouse orthotopic xenograft小节 |
| 小鼠原位异种移植 | 细胞接种数量：MDA-MB-231为5×10^5，MCF7为1×10^6，4T1为3×10^5；小鼠品系Rag−/− IL2γ−/− BALB/c和BALB/cN 阅读提示：Methods中Mouse orthotopic xenograft小节 |
| NAMPT增强子#3缺失 | 1 KB缺失，sgRNA序列见Supplementary Table 1 阅读提示：Methods中Plasmids小节及Supplementary Fig. 14 |
| 统计学分析 | 体外实验3个生物学重复，体内实验5个生物学重复；双因素方差分析、t检验等 阅读提示：Methods中Statistics and reproducibility小节 |