骨系细胞向髓系细胞转移线粒体的在体示踪
明确骨系细胞来源线粒体在骨髓各谱系细胞中的接收分布。
利用Prrx1cre、Col1a1cre/ERT2和Dmp1cre驱动的MitoDendra报告小鼠，收集骨髓细胞，流式细胞术检测Dendra2阳性细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
骨系细胞的线粒体调控髓系细胞介导的骨吸收
Mitochondria from osteolineage cells regulate myeloid cell-mediated bone resorption.
实验完整度
高包含体外共培养、线粒体移植、多种基因敲除小鼠模型、单细胞及RNA测序、代谢组学等多层级证据，并有功能与机制验证。
主要模型
Prrx1cre、Col1a1cre/ERT2、Dmp1cre骨系细胞线粒体报告小鼠 Prrx1creRhot1fl/fl等骨系细胞MIRO1敲除小鼠 原代颅骨及长骨成骨细胞与骨髓来源巨噬细胞（BMMs）共培养体系 糖皮质激素诱导的骨质疏松（GIOP）小鼠模型
重点核对
骨系细胞特异性MitoDendra报告小鼠中，流式细胞术检测Dendra2阳性髓系细胞比例（n=6） MIRO1敲除（Prrx1creRhot1fl/fl）后骨髓细胞线粒体转移减少及8周龄小鼠μCT骨量表型（n=5-8） OB与OCP直接共培养中mtD2pos与mtD2neg OCP的转录组及qPCR验证破骨基因下调（n=6） 线粒体移植后OCP的GSH水平及GSH代谢相关基因表达（n=7） GIOP模型中BSO腹腔注射（8 mmol/kg，每4天一次，8周）对骨量和破骨细胞活性的影响（n=6-7）
摘要
骨系细胞与髓系细胞之间的相互作用在维持骨骼稳态中发挥重要作用。本研究发现骨系细胞向髓系细胞转移线粒体。通过敲除骨系细胞中的MIRO1来损害线粒体转移，会导致髓系细胞向破骨细胞谱系定向增加并促进骨吸收。具体而言，来自骨系细胞的线粒体转移受损会改变谷胱甘肽代谢并保护破骨细胞谱系细胞免受铁死亡，从而促进破骨细胞活性。此外，骨系细胞向髓系细胞的线粒体转移参与糖皮质激素性骨质疏松的调控，而谷胱甘肽耗竭可缓解糖皮质激素性骨质疏松的进展。这些发现揭示了骨系细胞与髓系细胞之间相互作用调控骨骼代谢稳态的一种此前未被认识到的机制，并为糖皮质激素性骨质疏松的进展提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 骨系细胞是否通过向髓系细胞转移线粒体来调控骨骼代谢稳态，以及该过程在糖皮质激素性骨质疏松中的作用。
- 核心机制
- 骨系细胞通过MIRO1介导的线粒体转移抑制髓系细胞向破骨细胞分化；转移的线粒体抑制谷胱甘肽代谢，导致破骨细胞谱系细胞发生铁死亡，从而抑制骨吸收。
- 主要证据
- 利用骨系细胞特异性线粒体报告小鼠和MIRO1敲除小鼠，结合流式细胞术、μCT、组织形态计量学、RNA测序、代谢组学及线粒体移植实验，证明线粒体转移受损导致破骨细胞活性增加和骨丢失，而GSH耗竭可缓解GIOP进展。
- 研究意义
- 揭示了骨系细胞与髓系细胞之间通过线粒体转移调控骨骼代谢稳态的此前未被认识的机制，并为糖皮质激素性骨质疏松的进展提供了见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
骨系细胞向破骨细胞谱系细胞转移线粒体的体外验证
验证骨系细胞是否向破骨细胞谱系细胞转移线粒体及其方向性和接触依赖性。
提取Prrx1creMitoDendra+/+小鼠成骨细胞与mT/mG小鼠BMMs诱导的OCPs共培养，流式细胞术及超分辨荧光显微镜检测线粒体转移；Transwell实验检测接触依赖性。
线粒体转移对破骨细胞功能的影响
确定接收骨系细胞线粒体是否影响破骨细胞分化和骨吸收功能。
分选mtD2pos和mtD2neg OCPs，进行RNA测序、qPCR、TRAP染色和骨吸收实验。
MIRO1介导线粒体转移的遗传学验证
验证MIRO1在骨系细胞线粒体转移中的作用。
在OBs中敲低或过表达MIRO1，并构建Prrx1creRhot1fl/fl及Prrx1creRhot1fl/flMitoDendra+/+小鼠，检测线粒体转移。
MIRO1缺失对骨表型的影响
确定骨系细胞MIRO1缺失是否导致骨丢失及骨吸收增强。
对8周龄Prrx1creRhot1fl/fl和Col1a1cre/ERT2Rhot1fl/fl小鼠进行μCT、组织形态计量学、血清ELISA及体外成骨/破骨实验。
线粒体移植改变破骨细胞谱系细胞代谢
揭示骨系细胞来源线粒体对受体细胞代谢的影响。
将成骨细胞来源线粒体移植入BMMs、OCPs和mOCs，进行RNA测序、非靶向代谢组学及Seahorse分析。
GSH代谢-铁死亡通路的机制验证
验证线粒体转移通过抑制GSH代谢诱导铁死亡。
检测GSH水平、GSH代谢基因表达，并使用Erastin、BSO、GSH、NAC、Fer-1处理，进行CCK-8、Liperfluo、FerroOrange、TUNEL及TEM。
GIOP模型中的线粒体转移及BSO干预
探究线粒体转移在糖皮质激素性骨质疏松中的作用及GSH耗竭的干预效果。
给予小鼠糖皮质激素饮用水8周，检测线粒体转移；并用BSO腹腔注射干预，评估骨表型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD16/32抗体 | Biolegend | 101302 |
| 抗CD45-Pacific Blue抗体 | Biolegend | 157212 | |
| 抗CD11b-Alexa Fluor 700抗体 | Biolegend | 101202 | |
| 抗CD11b-APC/Cy7抗体 | Biolegend | 101225 | |
| 抗F4/80-Brilliant Violet 510抗体 | Biolegend | 123135 | |
| 抗Ly-6G-PE/Cy7抗体 | Biolegend | 127617 | |
| 抗CD45R-APC抗体 | Biolegend | 103212 | |
| CytoFlex流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 细胞培养 | α-MEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- | |
| 核因子κB受体活化因子配体 | Peprotech | -- | |
| Ficoll-Paque密度梯度分离液 | GE Healthcare | -- | |
| 成骨细胞提取 | 胶原酶 | Roche | -- |
| 中性蛋白酶 | Roche | -- | |
| II型胶原酶 | Sigma | -- | |
| 成骨诱导 | 成骨诱导分化培养基 | Cyagen | -- |
| 破骨诱导与染色 | TRAP染色试剂盒 | Sigma | -- |
| 骨吸收实验 | 骨仿生合成表面培养板 | Corning | -- |
| qPCR | RNeasy Mini RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| PrimeScript逆转录预混液 | Takara | RR036A | |
| SYBR Premix Ex Taq II预混液 | Takara | RR820L | |
| Western blot | 抗MIRO1抗体 | abcam | ab211363 |
| 抗VDAC抗体 | Cell Signaling Technology | 4661 | |
| 抗MFN2抗体 | Cell Signaling Technology | 9482 | |
| Pierce ECL化学发光底物 | Thermo Fisher | 953 | |
| 线粒体检测 | MitoTracker Green线粒体荧光探针 | Thermo Fisher | M7514 |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX线粒体超氧化物探针 | Thermo Fisher | M36008 |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1膜电位荧光探针 | Thermo Fisher | T3168 |
| 线粒体分离 | 线粒体分离试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞活力检测试剂盒 | DOJINDO | CK04 |
| 铁死亡染色 | FerroOrange染色试剂盒 | DOJINDO | F374 |
| Liperfluo染色试剂盒 | DOJINDO | L248 | |
| TUNEL实验 | TUNEL检测试剂盒 | Beyotime | C1086 |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 |
| 慢病毒筛选 | 杀稻瘟菌素 | Thermo Fisher | A1113902 |
| μCT扫描 | 微型CT扫描仪 | SkyScan | 1176 |
| μCT分析 | CTAn微型CT分析软件 | Bruker | version 1.13 |
| 组织形态计量学 | 钙黄绿素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 整体骨骼染色 | 阿尔新蓝 | Sigma | -- |
| 茜素红 | Sigma | -- | |
| GIOP模型 | 皮质酮 | Sigma | C2505 |
| BSO干预 | 丁硫氨酸亚砜亚胺 | Sigma | 19176 |
| 共培养诱导 | 1,25-二羟维生素D3 | Sigma | -- |
| 前列腺素E2 | Sigma | -- | |
| Seahorse分析 | 寡霉素 | Sigma | -- |
| 三氟甲氧基羰基氰基苯腙 | Sigma | -- | |
| 鱼藤酮 | Sigma | -- | |
| XFe96细胞外流量分析仪 | Seahorse Bioscience | -- | |
| 透射电镜 | Tecnai G2 Spirit 120 kV透射电子显微镜 | FEI | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 骨系细胞向髓系细胞线粒体转移的流式检测 | 报告小鼠品系（Prrx1cre、Col1a1cre/ERT2、Dmp1cre与MitoDendra+/+杂交）、每组样本量n=6（部分n=5）、流式抗体组合及Dendra2阳性门控策略 阅读提示：Methods流式细胞术部分及Fig. 1图注；Supplementary Fig. 1-2 |
| OB与OCP共培养及线粒体转移检测 | OB来源（Prrx1creMitoDendra+/+颅骨或长骨）、OCP来源（mT/mG小鼠BMMs）、M-CSF/RANKL浓度（100 ng/mL）、共培养时间（2天）、直接接触与Transwell非接触对照 阅读提示：Methods共培养部分及Fig. 2图注 |
| MIRO1敲除小鼠构建与骨表型分析 | Prrx1creRhot1fl/fl和Col1a1cre/ERT2Rhot1fl/fl小鼠构建策略、他莫昔芬诱导方案（约75 mg/kg，连续5天腹腔注射）、8周龄取材、μCT扫描参数及组织形态计量学分析标准 阅读提示：Methods小鼠部分、骨密度测量及骨组织形态计量学部分；Fig. 4-5图注 |
| 线粒体移植与代谢组学 | 线粒体分离试剂盒及移植量、移植后uptake效率（约13%）、RNA测序和UHPLC-MS/MS平台参数、代谢物差异筛选标准（VIP>1，P<0.05，FC≥2或≤0.5） 阅读提示：Methods线粒体分离、代谢组学及RNA测序部分；Fig. 6图注 |
| GIOP模型与BSO干预 | GC给药方式（50 μg corticosterone/mL饮用水，8周）、BSO剂量（8 mmol/kg）及给药频率（每4天一次，8周）、小鼠性别与周龄、骨表型检测终点 阅读提示：Methods GC treatment and BSO treatment in vivo部分；Fig. 7图注 |