临床样本与动物模型验证NF90/110和AGER1表达及钙化
探究NF90/110和AGER1在糖尿病动脉粥样硬化钙化中的表达变化。
对男性糖尿病患者和非糖尿病患者的冠状动脉进行Alizarin-red染色和免疫组化检测NF90/110、AGER1；在ApoE−/−糖尿病小鼠模型中同样检测。
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平滑肌NF90缺失通过FBXW7-AGER1-AGEs轴改善雄性小鼠糖尿病动脉粥样硬化钙化
Smooth muscle NF90 deficiency ameliorates diabetic atherosclerotic calcification in male mice via FBXW7-AGER1-AGEs axis.
实验完整度
高包含人冠状动脉样本、VSMC体外实验、ApoE−/−小鼠糖尿病模型及NF90/110敲除小鼠，并有泛素化、蛋白降解等机制验证。
主要模型
人主动脉血管平滑肌细胞（HAVSMCs） HEK293T细胞 雄性ApoE−/−糖尿病小鼠及VSMC特异性NF90/110敲除小鼠 男性糖尿病患者冠状动脉样本
重点核对
HAVSMCs高糖处理4天（27.5 mM）及AGE-BSA处理24小时（200 µg/ml） 雄性ApoE−/−小鼠STZ 50 mg/kg连续5天诱导糖尿病，高脂饮食12周 VSMC特异性NF90/110敲除小鼠通过tamoxifen 50 mg/kg连续5天诱导 FBXW7过表达腺相关病毒（AAV-FBXW7）尾静脉注射1.5×10^11 PFU/200 µl 每组n=10（动物）或n=5（细胞），独立实验至少3次
摘要
高血糖加速糖尿病患者的动脉粥样硬化斑块钙化，晚期糖基化终末产物（AGEs）的积累与动脉粥样硬化钙化密切相关。在此，我们展示高血糖介导的AGEs显著增加男性糖尿病动脉粥样硬化钙化样本中血管平滑肌细胞（VSMCs）NF90/110的活化。雄性小鼠中VSMC特异性NF90/110敲除明显减少AGEs诱导的动脉粥样硬化钙化，同时抑制VSMC向成骨细胞样细胞的表型改变、凋亡和基质囊泡释放。机制上，AGEs增加NF90活性，NF90通过稳定E3泛素连接酶FBXW7的mRNA增强AGE受体1（AGER1）的泛素化和降解，从而导致更多AGEs的积累和动脉粥样硬化钙化。总之，我们的研究表明VSMC NF90在介导AGEs代谢失衡以加速糖尿病动脉粥样硬化钙化中的作用。因此，抑制VSMC NF90可能是糖尿病动脉粥样硬化钙化的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- VSMC NF90/110在糖尿病动脉粥样硬化钙化中的作用及其机制尚不清楚，本研究旨在探究其角色。
- 核心机制
- AGEs增加NF90活性，NF90通过结合FBXW7 mRNA 3′-UTR的AU-rich元件增强其mRNA稳定性，上调FBXW7表达；FBXW7作为E3泛素连接酶促进AGER1泛素化降解，减少AGEs清除，导致AGEs积累，进而通过AGE-RAGE轴促进VSMC表型转换、凋亡和基质囊泡释放，加速动脉粥样硬化钙化。
- 主要证据
- 人冠状动脉样本和糖尿病小鼠模型中NF90/110表达升高、AGER1降低；VSMC NF90/110敲除减轻AGEs诱导的钙化、表型转换、凋亡和MVs释放；Co-IP、CHX chase、RIP等实验证实NF90-FBXW7-AGER1轴的泛素-蛋白酶体降解机制。
- 研究意义
- 研究揭示了VSMC NF90通过介导AGEs代谢失衡加速糖尿病动脉粥样硬化钙化的新机制，提示抑制VSMC NF90可能是糖尿病动脉粥样硬化钙化的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外高糖和AGEs处理VSMC验证NF90/110对钙化的影响
明确NF90/110在VSMC钙化中的作用。
HAVSMCs在高糖（27.5 mM）或AGE-BSA（200 µg/ml）条件下培养，通过shRNA敲低NF90/110，检测钙化（Alizarin-red染色、钙含量）、成骨标志物（Msx2、Runx2）表达。
VSMC特异性NF90/110敲除小鼠验证体内钙化
在体内验证VSMC NF90/110敲除对糖尿病动脉粥样硬化钙化的影响。
构建SM22a-creERT2介导的VSMC特异性NF90/110敲除小鼠，与ApoE−/−杂交，诱导糖尿病后检测动脉钙化、Msx2和Runx2表达。
蛋白质组学和分子实验筛选NF90/110下游靶点
探究NF90/110调控糖尿病钙化的分子机制。
对高糖处理的HAVSMCs进行蛋白质组测序，KEGG富集分析；验证AGER1表达变化；通过Co-IP、CHX chase、泛素化实验等验证NF90对AGER1的降解作用。
RNA免疫沉淀测序筛选NF90结合的泛素酶mRNA
寻找介导AGER1泛素化的E3连接酶。
AGE-BSA处理HAVSMCs后进行RNA免疫沉淀测序，筛选与NF90结合的泛素酶mRNA；验证FBXW7与AGER1的相互作用及泛素化。
FBXW7回补实验验证NF90-FBXW7-AGER1轴
确认NF90-FBXW7-AGER1轴在AGEs诱导的钙化中的作用。
在HAVSMCs中敲低NF90或FBXW7、过表达AGER1或FBXW7，检测VSMC表型转换、凋亡、MVs释放和钙化；在糖尿病NFSM-KO小鼠中注射AAV-FBXW7进行回补实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 链脲佐菌素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 他莫昔芬 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 平滑肌细胞培养基 | Sciencell | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素溶液 | -- | -- | |
| 杜尔贝科改良 Eagle 培养基 | Gibco | -- | |
| 诱导钙化 | β-甘油磷酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞处理 | 高浓度葡萄糖 | Sigma-Aldric | -- |
| AGE-牛血清白蛋白 | Biovision | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Biovision | -- | |
| MG132 | MCE | -- | |
| 氯喹 | MCE | -- | |
| 3-甲基腺嘌呤 | Selleck | -- | |
| 抗RAGE抗体 | Abcam | ab89911 | |
| 转染 | Lipo3000 | Invitrogen | -- |
| P3000 | Invitrogen | -- | |
| Opti培养基 | Gibco | -- | |
| 钙化检测 | 茜素红溶液 | Sigma-Aldrich | -- |
| 钙检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| ALP活性检测 | 碱性磷酸酶检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| AGEs检测 | 酶联免疫吸附检测试剂盒 | Biovision | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| NF90/110抗体 | Abcam | ab92355 | |
| β-actin抗体 | Sigma | SAB2100037 | |
| Msx2抗体 | Abcam | ab227720 | |
| Runx2抗体 | Cell Signalling Technology | 12556 | |
| BMP2抗体 | Novus | NBP1-19751 | |
| α-SMA抗体 | Sigma | A5228 | |
| OPN抗体 | Abcam | ab8448 | |
| Calponin抗体 | Abcam | ab46794 | |
| Bax抗体 | Cell Signaling Technology | 2772S | |
| Bcl-2抗体 | Affinity biosciences | AF6139 | |
| Cleaved-Caspase-3抗体 | Abcam | ab2302 | |
| AGER1抗体 | Proteintech | 14916-1-AP | |
| 泛素抗体 | Proteintech | 10201-2-AP | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| Myc标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 | |
| Flag标签抗体 | Sigma | F2555 | |
| 磷酸化STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9167 | |
| STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 14994 | |
| 磷酸化smad1/5抗体 | Cell Signaling Technology | 9516 | |
| Smad1/5抗体 | Abcam | ab300164 | |
| 磷酸化NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033S | |
| NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 6956S | |
| 磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511S | |
| p38抗体 | Cell Signaling Technology | 8690S | |
| 磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370S | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695S | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060S | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691S | |
| FBXW7抗体 | Abcam | ab109617 | |
| HECTD1抗体 | Abcam | ab101992 | |
| ARIH1抗体 | ABclonal | A17123 | |
| HUWE1抗体 | Abcam | ab271032 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠或抗兔二抗 | ZSGB-BIO | -- | |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒 | Takara | -- |
| HiScriptIIIRT SuperMix试剂盒 | Vazyme | -- | |
| SYBR Green Master mix试剂盒 | Roche | -- | |
| TUNEL染色 | 原位细胞死亡检测试剂盒 | Roche | -- |
| 流式细胞术 | PE Annexin V凋亡检测试剂盒I | BD Biosciences | -- |
| Co-IP | 免疫沉淀检测试剂盒 | Proteintech | -- |
| RNA免疫沉淀 | RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| RNA免疫沉淀测序 | TruSeq®链特异性总RNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Qubit® 2.0荧光定量仪 | Life Technologies | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| HiSeq X Ten测序仪 | Illumina | -- | |
| 蛋白质组测序 | Orbitrap Exploris 480质谱仪 | ThermoFisher | -- |
| MVs定量 | BCA蛋白检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| 细胞培养 | 磷酸盐缓冲液 | Gibco | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人冠状动脉样本 | 样本来源：男性糖尿病患者和非糖尿病患者，每组n=10；性别、年龄、糖尿病诊断标准需核对 阅读提示：Methods 'Human coronary artery samples'及Supplementary Table 3 |
| 糖尿病小鼠模型构建 | 小鼠品系：雄性ApoE−/−NFflox/flox和ApoE−/−NFSM-KO；STZ剂量50 mg/kg连续5天；高脂饮食12周；tamoxifen 50 mg/kg连续5天 阅读提示：Methods 'Animals' |
| HAVSMCs高糖和AGEs处理 | 细胞系HAVSMCs (CRL-1999)；高糖浓度27.5 mM处理4天；AGE-BSA浓度200 µg/ml处理24小时或21天；每组n=5 阅读提示：Methods 'Cell culture, treatment, and transfection'及图注 |
| NF90/110敲低和过表达 | shRNA序列、siRNA序列、转染试剂Lipo3000/P3000、MOI=10；敲低效率验证 阅读提示：Methods 'Plasmid, siRNA, and virus'和'Cell culture, treatment, and transfection' |
| FBXW7回补实验 | AAV-FBXW7剂量1.5×10^11 PFU/200 µl尾静脉注射；Ad-FBXW7转导；SM22α启动子特异性 阅读提示：Methods 'Animals'及'Plasmid, siRNA, and virus' |