临床样本与动物模型验证老年肝脏更易发生IRI和铁死亡
验证老年肝脏对IRI更敏感且铁死亡水平更高。
收集OLT供肝再灌注前后活检标本，检测血清AST/ALT、HE、TUNEL、DHE、C11 BODIPY、铁死亡相关蛋白；建立年轻与老年小鼠HIRI模型，检测肝损伤和铁死亡指标；分离原代肝细胞和诱导衰老THLE2细胞建立H/R模型验证。
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老年肝脏中FTO缺乏通过上调ACSL4和TFRC加剧缺血/再灌注损伤中的铁死亡
FTO deficiency in older livers exacerbates ferroptosis during ischaemia/reperfusion injury by upregulating ACSL4 and TFRC.
实验完整度
高含临床标本、小鼠HIRI模型、原代肝细胞和衰老细胞系，并有MeRIP-seq、CLIP-seq、AAV敲低等机制验证
主要模型
老年与年轻供肝患者肝活检样本及OLT队列 年轻与老年C57BL/6小鼠HIRI模型 原代小鼠肝细胞H/R模型 衰老THLE2细胞H/R模型
重点核对
HIRI模型：左中叶肝缺血90 min，再灌注12 h后取材；假手术组仅开腹 药物处理：Fer-1 20 mg/kg或FB23-2 20 mg/kg缺血前2 h腹腔注射；NMN 500 mg/kg缺血前4 h给药 AAV8敲低：shRNA-AAV8-ACSL4或TFRC经尾静脉注射，1×10^12 viral genomes·mL−1，3周后建立HIRI模型 细胞H/R模型：无血清条件下1% O2缺氧4 h，复氧2 h；衰老THLE2由100 μM H2O2处理3个循环诱导 临床分组：供体年龄<50岁为年轻组，>=50岁为老年组；OLT队列n=20，每组n=10
摘要
老年肝脏更易发生肝脏缺血/再灌注损伤（HIRI），这严重限制了其在肝移植中的应用。其潜在机制尚不清楚。在此，我们证明老年肝脏在HIRI期间表现出增强的铁死亡。抑制铁死亡可显著减轻老年HIRI表型。质谱分析显示，肥胖相关基因（FTO）在老年肝脏中表达下调，尤其是在HIRI期间。过表达FTO通过抑制铁死亡改善老年HIRI表型。机制上，酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）和转铁蛋白受体蛋白1（TFRC）这两个铁死亡的关键正调控因子是FTO的靶标。为发挥改善作用，FTO需要以m6A依赖性方式抑制Acsl4和Tfrc mRNA的稳定性。此外，我们证明烟酰胺单核苷酸可上调FTO去甲基化酶活性，抑制铁死亡并减轻老年HIRI。总之，这些发现揭示了FTO-ACSL4/TFRC调控通路参与老年HIRI的发病机制，为利用FTO去甲基化酶活性相关策略改善老年供肝移植后移植物功能的临床转化提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 老年肝脏在肝缺血/再灌注损伤中是否更易发生铁死亡，以及FTO/m6A修饰是否调控该过程并可作为干预靶点。
- 核心机制
- 老年肝脏FTO表达下调，导致Acsl4和Tfrc mRNA的m6A修饰增加，通过m6A阅读蛋白YTHDC2/YTHDF2增强其mRNA稳定性，上调ACSL4和TFRC，从而促进铁死亡并加剧HIRI；NMN可增强FTO去甲基化酶活性抑制该通路。
- 主要证据
- 临床OLT样本、年轻/老年小鼠HIRI模型、原代肝细胞和衰老THLE2细胞H/R模型显示老年肝脏铁死亡增强；MeRIP-seq和CLIP-seq证明FTO靶向Acsl4和Tfrc并降低其m6A；AAV8敲低ACSL4或TFRC可逆转FB23-2效应；NMN处理上调FTO活性并减轻老年HIRI。
- 研究意义
- 揭示FTO-ACSL4/TFRC调控通路在老年HIRI发病中的作用，提示增强FTO去甲基化酶活性（如NMN）可能作为改善老年供肝移植后移植物功能的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
药理学抑制铁死亡验证其在老年HIRI中的作用
明确铁死亡对老年HIRI的贡献。
老年小鼠给予Fer-1后建立HIRI模型，检测血清AST/ALT、HE、TUNEL、DHE、C11 BODIPY；原代肝细胞和衰老THLE2细胞H/R中给予Fer-1，检测细胞死亡、ROS和脂质过氧化。
蛋白质组学筛选并验证FTO在老年HIRI中的下调
寻找调控老年HIRI的关键分子。
对年轻和老年小鼠HIRI肝组织进行LC-MS差异蛋白分析，结合筛选标准锁定FTO；用Western blot、IHC验证FTO在人和小鼠肝组织及细胞中的表达；dot blot检测m6A水平。
FTO功能获得/缺失验证其对铁死亡和老年HIRI的调控
验证FTO是否通过抑制铁死亡减轻老年HIRI。
在老年小鼠中过表达或抑制FTO（FB23-2），联合Fer-1处理，检测肝损伤和铁死亡指标；在原代肝细胞和衰老THLE2细胞中过表达、沉默FTO或使用FB23-2，结合Fer-1或erastin处理，检测细胞死亡、ROS和脂质过氧化。
MeRIP-seq和CLIP-seq鉴定FTO下游靶标及m6A调控机制
阐明FTO调控铁死亡的关键下游分子和表观转录机制。
在衰老THLE2细胞中转染对照或FTO过表达质粒并行H/R，进行MeRIP-seq和FTO-CLIP-seq；MeRIP-qPCR验证Acsl4和Tfrc的m6A水平；RT-qPCR和Western blot检测ACSL4/TFRC表达；放线菌素D实验检测mRNA半衰期；RIP验证YTHDC2/YTHDF2结合。
AAV8介导ACSL4/TFRC敲低验证FTO效应的依赖性
验证FTO减轻老年HIRI是否依赖ACSL4和TFRC。
老年小鼠尾静脉注射shRNA-AAV8-ACSL4或shRNA-AAV8-TFRC，3周后建立HIRI模型并给予FB23-2，检测肝损伤、ROS、脂质过氧化、线粒体形态和铁死亡蛋白；体外过表达或敲低ACSL4/TFRC结合FTO调控，检测细胞死亡和脂质过氧化。
NMN增强FTO去甲基化酶活性减轻老年HIRI
评估NMN通过增强FTO活性抑制铁死亡并缓解老年HIRI的潜力。
老年小鼠给予NMN后建立HIRI模型，检测血清AST/ALT、HE、TUNEL、m6A dot blot、DHE、C11 BODIPY、铁死亡蛋白和TEM。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | Ferrostatin-1 | Selleck | S7243 |
| FB23-2 | MCE | HY-127103 | |
| 烟酰胺单核苷酸 | Selleck | S5259 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma‒Aldrich | D5879-500ML | |
| ROS检测 | 二氢乙锭 | MCE | HY-D0079 |
| 脂质过氧化检测 | C11 BODIPY试剂 | GLPBIO | GC40165 |
| 细胞培养 | BEGM培养基试剂盒 | Lonza/Clonetics Corporation | CC3170 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 原代肝细胞分离 | H型胶原酶 | Sigma‒Aldrich | 11087789001 |
| Percoll分离液 | GE Healthcare | 17089109 | |
| 细胞培养 | 地塞米松 | Sigma‒Aldrich | D1756-25MG |
| 衰老诱导 | 衰老细胞组织化学染色试剂盒 | Sigma-Aldrich | CS0030 |
| TUNEL检测 | 一步法TUNEL凋亡检测试剂盒 | Beyotime | C1088 |
| 细胞死亡检测 | Calcein-AM/PI双染试剂盒 | Beyotime | C2015 |
| 免疫组化 | QuickBlock封闭缓冲液 | Beyotime | P0260 |
| Dako REAL EnVision检测系统 | Dako | K5007 | |
| 免疫荧光 | DAPI | KeyGen | KGA1523 |
| Triton | Sigma‒Aldrich | T8787-50ML | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma‒Aldrich | V900933-100G | |
| Western blot | BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol | Invitrogen | 15596018 |
| Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒 | Roche Applied Science | -- | |
| 质粒转染 | ViaFect转染试剂 | Promega | E4982 |
| siRNA转染 | Lipofectamine 3000试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| MeRIP-qPCR | riboMeRIP m6A转录组分析试剂盒 | RiboBio | C11051-1 |
| miRNeasy迷你试剂盒 | QIAGEN | 217004 | |
| 脂质组学 | 叔丁基甲基醚 | Sigma-Aldrich | 650560-1 L |
| m6A dot blot | 抗N6-甲基腺苷（m6A）抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| 亚甲蓝 | Sigma‒Aldrich | M4159 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠HIRI模型 | 缺血时间（90 min）、再灌注时间（12 h）、缺血肝叶（左中叶）、麻醉剂（1%戊巴比妥钠，100 μl/10 g）、假手术对照 阅读提示：Methods中的Establishment of the mouse HIRI model小节 |
| 药物处理（Fer-1、FB23-2、NMN） | 剂量（Fer-1 20 mg/kg；FB23-2 20 mg/kg；NMN 500 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、给药时间（缺血前2 h或4 h）、溶剂（2% DMSO/5% Tween-80或生理盐水） 阅读提示：Methods中的Establishment of the mouse HIRI model小节 |
| AAV8介导基因敲低 | 病毒剂量（1×10^12 viral genomes·mL−1）、注射途径（尾静脉）、注射后时间（3周后建立HIRI）、shRNA序列、分组（7组） 阅读提示：Methods中的Animal adeno-associated virus-8 (AAV8) injection and processing小节 |
| 细胞H/R模型 | 缺氧条件（1% O2，5% CO2，94% N2，4 h）、复氧时间（2 h）、血清饥饿、细胞类型（原代肝细胞、衰老THLE2） 阅读提示：Methods中的In vitro hypoxia reoxygenation (H/R) model小节 |
| THLE2细胞衰老诱导 | H2O2浓度（100 μM）、处理时间（30 min）、恢复时间（23.5 h）、循环次数（3次） 阅读提示：Methods中的Induction of THLE2 cell senescence with hydrogen peroxide (H2O2)小节 |
| mRNA稳定性检测 | 放线菌素D浓度（5 μg/ml）、收样时间点（0、3、4、6、8、12 h） 阅读提示：Methods中的mRNA stability assays小节 |
| 临床样本分组 | 供体年龄 cutoff（年轻<50岁，老年>=50岁）、样本量（n=20）、再灌注前标本收集时间（冷灌注后3 h内）、再灌注后标本收集时间（肝动脉吻合后2 h内） 阅读提示：Methods中的Clinical data and human liver sample collection小节及Results第一段 |