BODIPY-C12在过氧化物酶体中的积累验证
验证BODIPY-C12是否特异性染色活细胞中的过氧化物酶体
用BODIPY-C12染色活HEK293T、U2OS细胞，与GFP-SKL共定位，并在PEX19 KO细胞中验证特异性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
用于过氧化物酶体活细胞成像的荧光脂肪酸偶联物
Fluorescent fatty acid conjugates for live cell imaging of peroxisomes.
实验完整度
高包含体外细胞模型（多种细胞系及CRISPR敲除）、患者来源iPSC和成纤维细胞、斑马鱼胚胎及拟南芥多种模型，并进行功能与机制验证。
主要模型
HEK293T细胞系（野生型及CRISPR/Cas9敲除） 患者来源iPSC和成纤维细胞 斑马鱼胚胎 拟南芥幼苗和原生质体
重点核对
BODIPY-C12和PeroxiSPY在WT、PEX19 KO、PEX5 KO、PMP70 KO和VAPA/VAPB KO细胞中的过氧化物酶体染色特异性及共定位 PeroxiSPY650与BODIPY-C12竞争实验：1:1.2 μM比例下BODIPY-C12荧光半数丢失 患者来源PEX10突变iPSC中GFP-SKL导入延迟及PeroxiSPY650染色强度降低 斑马鱼胚胎（16-22 hpf）中BODIPY-C12和PeroxiSPY的过氧化物酶体染色 拟南芥中BODIPY-C12和PeroxiSPY650不与GFP-SKL过氧化物酶体标记共定位
摘要
过氧化物酶体是真核细胞器，对多种代谢途径至关重要，包括脂肪酸氧化、氨基酸降解和醚脂生物合成。因此，过氧化物酶体功能障碍会导致儿童期发病的神经退行性疾病，包括过氧化物酶体生物发生障碍（PBD）。由于过氧化物酶体的生物发生和功能具有动态、组织特异性和环境依赖性，过氧化物酶体的活细胞成像对于研究过氧化物酶体调控以及诊断PBD相关异常至关重要。然而，过氧化物酶体成像工具在许多方面仍然缺乏，既没有底物输入的报道分子，也没有能够染色功能障碍过氧化物酶体的细胞通透性探针。在此我们报道，BODIPY-C12荧光脂肪酸探针可染色活哺乳动物细胞中的功能性和功能障碍性过氧化物酶体。我们进一步改进BODIPY-C12，生成了过氧化物酶体特异性试剂PeroxiSPY650和PeroxiSPY555。这些探针结合了高过氧化物酶体特异性、红和远红光谱的明亮荧光以及快速非细胞毒性染色，使其成为过氧化物酶体活细胞、整个生物体或组织成像的理想工具。最后，我们证明PeroxiSPY能够诊断PBD CRISPR/Cas9细胞模型和患者来源细胞系中的过氧化物酶体异常。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发出高效、特异的荧光探针用于活细胞及组织中过氧化物酶体的成像，并用于诊断过氧化物酶体功能障碍？
- 核心机制
- BODIPY-C12和PeroxiSPY染料通过过氧化物酶体膜转运蛋白（如PMP70）依赖的机制进入过氧化物酶体，其积累依赖于过氧化物酶体功能，尤其是基质蛋白导入。
- 主要证据
- 在多种细胞系（WT、PEX19 KO、PEX5 KO、PMP70 KO、VAPA/VAPB KO）中验证染料特异性；在患者来源iPSC和成纤维细胞中检测过氧化物酶体异常；在斑马鱼胚胎中实现活体成像；在拟南芥中验证染料不染色过氧化物酶体。
- 研究意义
- PeroxiSPY探针为过氧化物酶体活细胞、组织和整个生物体成像提供了新工具，并可用于PBD的快速诊断和过氧化物酶体功能研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PeroxiSPY染料的合成与筛选
通过化学修饰BODIPY-C12，合成具有更高过氧化物酶体特异性的染料
将SiR和MaP555染料与C16、C18、C20脂肪酸通过点击化学偶联，筛选最佳染料（PeroxiSPY650和PeroxiSPY555）。
PeroxiSPY染料特异性及机制验证
验证PeroxiSPY染料的过氧化物酶体特异性及其进入机制
在WT和PEX19 KO细胞中比较PeroxiSPY与BODIPY-C12的染色；在PEX5 KO、PMP70 KO、VAPA/VAPB KO细胞中检测染色变化；进行竞争实验。
患者细胞中过氧化物酶体异常的检测
评估BODIPY-C12和PeroxiSPY在PBD患者细胞中诊断过氧化物酶体异常的能力
在PEX10突变iPSC和PEX3缺失成纤维细胞中染色过氧化物酶体，并与对照比较。
斑马鱼胚胎活体成像
验证染料是否可用于活体组织成像
将BODIPY-C12和PeroxiSPY用于斑马鱼胚胎染色，并与GFP-SKL标记共定位。
拟南芥中染料特异性测试
检验染料在植物细胞中的适用性
在表达GFP-SKL的拟南芥幼苗根和原生质体中测试BODIPY-C12和PeroxiSPY650的染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | Sigma | -- | |
| mTSER1培养基 | STEM CELL Technologies | -- | |
| mTESRPlus培养基 | STEM CELL Technologies | -- | |
| 细胞计数 | Countess II FL细胞计数器 | Life Technologies | -- |
| 细胞计数板 | Invitrogen | -- | |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47724 |
| 抗PMP70抗体 | Sigma | SAB4200181 | |
| 抗PEX19抗体 | Proteintech | 14713-1-AP | |
| 抗PEX5抗体 | Sigma | HPA039260 | |
| 抗VAPB抗体 | ProteinTech | 14477-1-AP | |
| 抗PEX10抗体 | St John’s Laboratory | STJ119242 | |
| 抗VAPA抗体 | SantaCruz Biotech | sc-293278 | |
| 抗PEX14抗体 | Proteintech | 10594-1-AP | |
| 免疫荧光 | Cy3偶联抗兔IgG | Sigma-Aldrich | C2306 |
| Cy3偶联抗鼠IgG | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| Cy5偶联抗兔IgG | Invitrogen | A10523 | |
| Alexa Fluor® 488抗鼠IgG H&L | Abcam | -- | |
| 细胞染色 | Hoechst染料 | Sigma | -- |
| 细胞培养 | 无脂肪酸BSA | PAN | -- |
| 过氧化物酶体染色 | BODIPY-C12荧光脂肪酸探针 | ThermoFisherScientific | D3835 |
| BODIPY-FL-C12绿色荧光脂肪酸探针 | ThermoFisherScientific | D3822 | |
| 脂滴染色 | 尼罗红 | Sigma | -- |
| BODIPY染料 | ThermoFisherScientific | D3922 | |
| BODIPY-胆固醇 | Setareh Biotech | 7356 | |
| BODIPY甲酯 | ThermoFisherScientific | C34556 | |
| 化学合成 | 癸酸 | Carl Roth | 8797.1 |
| 甘油三棕榈油酸酯 | Sigma | T2630-100MG | |
| 卵磷脂 | Carl Roth | 9812.1 | |
| 质粒构建 | pSpCas9(BB)−2A-Puro (PX459) V2.0质粒 | Addgene | 62988 |
| 细胞毒性检测 | 细胞毒性检测试剂盒PLUS (LDH) | Sigma | 4744926001 |
| 细胞生长检测 | Hoechst33342染料 | -- | -- |
| 96孔板 | PerkinElmer | -- | |
| GE INCell2200自动荧光显微镜 | GE | -- | |
| 显微成像 | SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 60倍PlanApo VC油镜 NA 1.40 | Leica | -- | |
| 4孔玻璃底培养板 | IBIDI | -- | |
| Cell-view细胞培养皿 | Greiner Bio One | -- | |
| 玻璃载玻片 | Marienfeld | -- | |
| 斑马鱼显微注射 | mMESSAGE mMACHINE™ T7转录试剂盒 | -- | AM1344 |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| 放射性测量 | 13,14-3H二十二烷酸 | Anawa | -- |
| 化学合成 | SiR叠氮化物 | Spirochrome | SC009 |
| 15-十六碳炔酸 | -- | -- | |
| 17-十八碳炔酸 | -- | -- | |
| 19-二十碳炔酸 | Spirochrome AG | -- | |
| Map555-羧酸 | -- | -- | |
| TBTA | -- | -- | |
| 硫酸铜 | -- | -- | |
| 抗坏血酸钠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BODIPY-C12和PeroxiSPY的活细胞染色 | 染料浓度：BODIPY-C12 1 μg/ml或0.1 μg/ml，PeroxiSPY 1 μM；染色时间：10分钟；细胞汇合度40-80%；Hoechst 10 μg/ml 阅读提示：Methods中的“Peroxisome labeling”小节及Figure 1、2、3图注 |
| CRISPR/Cas9敲除细胞系构建 | 靶序列：PMP70 C-terminus 5’-CGGCTCGCTGGTACCGGCAGTGCCA-3’，PEX5 5’-GGGGTGCCAACCCGCTCATGAAGCTCGC-3’，PEX19 5’-GGAGGTAGCAAGATGGCCGCCGCTG-3’；嘌呤霉素筛选浓度1 μg/ml 阅读提示：Methods中的“CRISPR/Cas9”和“Cell culture and cell lines”小节 |
| 患者来源iPSC和成纤维细胞染色 | 细胞类型：PEX10突变iPSC和PEX3缺失成纤维细胞；染料浓度：BODIPY-C12 0.1 μg/ml，PeroxiSPY650 1 μM；染色时间：15分钟至2小时 阅读提示：Figure 5图注及Results中“Peroxisome staining enables the identification of peroxisome abnormalities in patient cells”部分 |
| 斑马鱼胚胎染色 | 胚胎阶段：16-22 hpf；染料浓度：1 μM；染色时间：10分钟或更长；去壳处理；E3培养基 阅读提示：Methods中的“Zebrafish maintenance”和“Zebrafish microscopy”小节及Supplementary Fig. 7、8 |
| 放射性脂肪酸氧化测量 | 底物：冷C22:0 4 μM和13,14-3H C22:0 1 μCi；孵育时间20小时；细胞密度100,000细胞/孔；闪烁计数 阅读提示：Methods中的“Radioactive measurement of beta fatty acid oxidation using 13,14-3H docosanoic acid (C22:0)”小节 |
| 拟南芥染色 | 植物材料：21天龄幼苗根和3周龄叶片原生质体；染料浓度1 μM；孵育后成像 阅读提示：Methods中的“Plant growth and staining”小节及Supplementary Fig. 8e–g |