HOIP结构域组织相互作用组图谱构建
系统鉴定HOIP四个结构域在九种小鼠组织中的相互作用蛋白。
表达并纯化GST-HOIP PUB、NZF、UBA、RBR-LDD及GST对照，与九种小鼠组织裂解液进行GST pull-down，结合质谱鉴定相互作用蛋白。
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系统性HOIP相互作用组分析揭示线性泛素化在组织稳态中的关键作用
Systematic HOIP interactome profiling reveals critical roles of linear ubiquitination in tissue homeostasis.
实验完整度
高包含小鼠九组织AP-MS、细胞系、骨特异性敲除小鼠及多种功能与机制验证。
主要模型
九种小鼠组织（脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、结直肠、骨） HEK293T、HeLa、3T3-E1细胞 骨髓间充质干细胞（BMSCs） 成骨细胞特异性Hoip敲除小鼠
重点核对
GST pull-down与质谱鉴定HOIP结构域相互作用组，三次重复，FOC≥2且PFOC≤0.05 ILK线性泛素化位点为K209和K220，2KR突变体（K209R/K220R）泛素化几乎完全消失 SMURF1线性泛素化位点为K357、K624、K667和K713，4KR突变体影响E2-E3相互作用 成骨细胞特异性Hoip敲除小鼠（HoiploxP/loxPOsx-Cre+）骨量减少表型 福氏志贺菌感染HeLa细胞（MOI 100）后ILK线性泛素化动态变化
摘要
由线性泛素化组装复合体关键组分HOIL-1相互作用蛋白（HOIP）催化的线性泛素化，通过执行结构域特异性调控功能在组织稳态中发挥基础性作用。然而，跨组织HOIP结构域特异性相互作用组的蛋白质组范围分析尚属空白。本文中，我们呈现了九种小鼠组织中四个HOIP结构域的全面基于质谱的相互作用组分析。该相互作用数据集提供了高质量的HOIP相互作用组资源，每种组织中每个诱饵平均约90个相互作用蛋白。HOIP组织相互作用组提供了对每个组织中线性泛素化功能的系统性理解，并显示组织功能与遗传疾病的关联。HOIP结构域相互作用组鉴定了一组先前未定义的线性泛素化底物，并阐明了生理和病理过程中HOIP结构域间的交叉对话。此外，我们显示整合素连接蛋白激酶（ILK）的线性泛素化减少黏着斑形成并促进福氏志贺菌感染细胞的脱落。同时，Hoip缺失降低Smad泛素化调节因子1（SMURF1）的线性泛素化并增强其E3活性，最终导致小鼠骨量减少表型。总体而言，我们的工作扩展了HOIP相互作用蛋白的知识，并为进一步发现线性泛素化在组织稳态中的功能提供了平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HOIP的结构域特异性相互作用组在多种组织中如何分布，线性泛素化在组织稳态中发挥哪些功能？
- 核心机制
- LUBAC介导的ILK线性泛素化破坏OspE与ILK的相互作用，促进黏着斑周转和感染细胞脱落；SMURF1线性泛素化破坏E2-E3相互作用，降低其E3活性，从而促进成骨。
- 主要证据
- 九种小鼠组织四个HOIP结构域的AP-MS相互作用组；ILK线性泛素化位点突变及福氏志贺菌感染细胞实验；SMURF1线性泛素化位点突变及成骨细胞特异性Hoip敲除小鼠骨表型分析。
- 研究意义
- 扩展了HOIP相互作用蛋白知识，提供了进一步发现线性泛素化在组织稳态中功能的平台，并揭示了线性泛素化在细菌感染和骨发育中先前未定义的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织共享与特异性相互作用组分析
区分组织共享和組織特异性HOIP相互作用蛋白，并关联组织功能与疾病。
基于质谱数据计算Jaccard指数，定义在至少六种组织中检测到的PPI为组织共享，仅一种组织中检测到的为潜在组织特异性；进行GO富集和OMIM疾病关联分析。
HOIP结构域特异性相互作用组及底物鉴定
比较四个HOIP结构域介导的相互作用网络，鉴定潜在线性泛素化底物。
对每个结构域相互作用的蛋白进行富集分析；利用线性泛素化实验验证NZF结构域识别的新候选底物。
ILK线性泛素化及功能验证
验证ILK为HOIP底物，并研究其线性泛素化在福氏志贺菌感染中的作用。
免疫共沉淀验证ILK与HOIP相互作用；线性泛素化实验鉴定修饰位点；在HeLa细胞中敲低HOIP或表达ILK-2KR突变体，进行福氏志贺菌感染、免疫荧光、细胞黏附及细菌载量检测。
SMURF1线性泛素化及E3活性调控机制
验证SMURF1为HOIP底物，并阐明线性泛素化对其E3活性的调控机制。
在HEK293T细胞和BMSCs中验证HOIP与SMURF1相互作用及线性泛素化；鉴定线性泛素化位点；检测SMURF1与E2、底物相互作用及底物泛素化水平。
成骨细胞特异性Hoip敲除小鼠骨表型分析
研究HOIP在骨发育中的生理功能。
构建HoiploxP/loxPOsx-Cre+小鼠，分析体重、骨生物力学、血清骨形成/吸收标志物、micro-CT、组织学染色及BMSCs成骨分化能力。
SMURF1抑制剂 Rescue 实验
验证HOIP通过拮抗SMURF1 E3活性促进成骨。
用SMURF1抑制剂A17处理HOIP CKO BMSCs，检测成骨标志物mRNA和蛋白水平及ALP染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| GST pull-down | GST标签纯化树脂 | Beyotime | P2251 |
| 质谱 | Orbitrap Fusion lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Easy-nLC 1200纳升液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | C11995500BT-1 |
| 胎牛血清 | Cellmax | SA301.02.V | |
| α-MEM培养基 | Gibco | C12571500BT | |
| 胎牛血清 | Gemini | 900-108 | |
| 青霉素/链霉素 | CellWorld | C0160-611 | |
| 质粒转染 | StarFect转染试剂 | GenStar | C101-10 |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Santa Cruz | -- |
| Ni-NTA pull-down | 镍-次氮基三乙酸琼脂糖 | QIAGEN | 30210 |
| 成骨分化与矿化 | 成骨分化基础培养基 | Cyagen | MUXMT-03021-175 |
| ALP染色 | 碱性磷酸酶检测试剂盒 | Beyotime | C3206 |
| 矿化染色 | 茜素红S | Solarbio | G1452 |
| CFU-F和CFU-Ob实验 | 结晶紫草酸铵溶液 | Solarbio | G1062 |
| 钙黄绿素双标 | 钙黄绿素 | Sigma | 40 mg/kg |
| 组织切片 | 冷冻切片机 | RWD Minux | FS800 |
| 荧光扫描 | Pannoramic MIDI扫描仪 | 3 DHISTECH | -- |
| 慢病毒感染 | 5×慢病毒浓缩试剂 | GenStar | C103 |
| 细菌感染与细胞黏附实验 | 结晶紫 | -- | -- |
| Multiscan sky酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细菌CFU实验 | 庆大霉素 | -- | 50 μg/ml |
| 组织学染色 | TRAP染色 | Solarbio | G1492 |
| 番红O/固绿染色 | Solarbio | G1371 | |
| RNA提取与逆转录 | TRIzol试剂 | Sigma | T9424 |
| 逆转录 | ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 |
| qPCR | QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 2× RealStar Fast SYBR qPCR Mix | GenStar | A301 | |
| 免疫印迹 | SuperSignal West Pico PLUS化学发光检测试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Alexa Fluor 488重组多克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | 710369 | |
| 山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11012 | |
| 驴抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-31573 | |
| 免疫印迹 | 山羊抗兔IgG（H+L）二抗 | Thermo Fisher Scientific | 65-6120 |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，HRP | Thermo Fisher Scientific | 31430 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HOIP结构域组织相互作用组构建 | 组织类型（九种小鼠组织）、HOIP结构域（PUB、NZF、UBA、RBR-LDD）、三次重复、FOC≥2且PFOC≤0.05阈值 阅读提示：Methods中GST pull-down and sample preparation for mass spectrometry及Results第一部分；Supplementary Data 1-2 |
| ILK线性泛素化及福氏志贺菌感染实验 | ILK突变体（K209R、K220R、2KR）、福氏志贺菌MOI 100、感染时间点、HOIP敲低、每组n=3或n=30 阅读提示：Methods中Bacterial infection and cell adhesion assay、Bacterial Colony-forming units (CFU) assay及图4图注 |
| SMURF1线性泛素化及E3活性分析 | SMURF1突变体（K357R、K624R、K667R、K713R）、HOIP-CS突变体、OTULIN C129A突变体、BMSCs中HOIP敲低/过表达 阅读提示：Methods中Plasmids, cell transfection and immunoprecipitation及图5图注；Supplementary Fig. 8 |
| 成骨细胞特异性Hoip敲除小鼠骨表型分析 | 小鼠品系（HoiploxP/loxP与Osx-Cre）、对照组与敲除组、8周龄雄性、每组n=5/6/3、BMSCs成骨诱导14天和28天 阅读提示：Methods中Mouse strains、In vitro osteoblastic differentiation and mineralization、Micro CT analysis and biomechanical test及图6、图7图注 |
| SMURF1抑制剂A17 rescue实验 | A17处理浓度：文中未明确说明；处理时间28天（qPCR）和14天（ALP染色）；每组n=3 阅读提示：Results中Deletion of Hoip causes a reduced bone mass phenotype末段及图7h、i图注 |