他汀类药物上调内皮细胞circRNA-RBCK1表达
确定他汀类药物对circRNA表达谱的影响及circRNA-RBCK1在内皮细胞中的上调作用
对HUVECs进行RNA测序分析circRNA表达谱，并用定量PCR在HUVECs及四种内皮细胞中验证洛伐他汀、普伐他汀和阿托伐他汀对circRNA-RBCK1的上调作用
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他汀类药物通过上调circRNA-RBCK1改善心脏内皮功能以预防射血分数保留型心力衰竭
Statins improve cardiac endothelial function to prevent heart failure with preserved ejection fraction through upregulating circRNA-RBCK1.
实验完整度
高含体外内皮细胞、报告基因、ChIP、EMSA、Pull-down及体内HFpEF小鼠模型、内皮特异基因敲除与AAV9敲低的多层功能与机制验证
主要模型
人脐静脉内皮细胞（HUVECs） 人心内膜内皮细胞（EECs） 人心肌毛细血管内皮细胞（MCECs） HFD+AngII诱导的HFpEF雄性小鼠模型
重点核对
洛伐他汀处理浓度10 μM、24 h；普伐他汀20 μM；阿托伐他汀10 μM ox-LDL处理浓度100 μg/ml、24 h HFD联合AngII以0.2 mg/kg/day持续12周诱导HFpEF 洛伐他汀4 mg/kg/day，于HFD+AngII前1周开始给药 他莫昔芬2 mg/mouse连续5天诱导内皮AP-2α敲除；AAV9尾静脉1×10^11 IFU/只
摘要
射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）与内皮功能障碍相关。我们此前报道他汀类药物通过抑制microRNA-133a（miR-133a）预防内皮功能障碍。本研究旨在探讨他汀类药物对HFpEF的作用及其潜在机制。本研究发现他汀类药物上调一种环状RNA（circRNA-RBCK1）的表达，该环状RNA与RBCK1基因共转录。同时，他汀类药物增加激活蛋白2α（AP-2α）转录活性以及circRNA-RBCK1与miR-133a之间的相互作用。此外，AP-2α在内皮细胞中直接与RBCK1基因启动子相互作用。在体内，洛伐他汀改善HFpEF雄性小鼠的舒张功能，而内皮AP-2α或circRNA-RBCK1功能缺失可消除该作用。本研究提示他汀类药物上调AP-2α/circRNA-RBCK1信号以抑制心脏内皮细胞中的miR-133a，并预防HFpEF的舒张功能障碍。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 他汀类药物是否通过circRNA介导的miR-133a抑制来预防心脏内皮功能障碍并改善HFpEF舒张功能，其机制为何。
- 核心机制
- 他汀类药物激活转录因子AP-2α，AP-2α结合RBCK1基因启动子促进circRNA-RBCK1表达；circRNA-RBCK1作为miR-133a海绵抑制miR-133a，上调GTPCH1/BH4/eNOS信号，改善心脏内皮功能。
- 主要证据
- 体外HUVECs、EECs、MCECs及HEK293报告基因、RNA pull-down、ChIP、EMSA实验；体内洛伐他汀改善HFD+AngII诱导的HFpEF雄性小鼠舒张功能，该作用被内皮特异性AP-2α敲除或AAV9介导的circRNA-RBCK1敲低所消除。
- 研究意义
- 揭示了HFpEF中舒张功能障碍的病理生理机制，并发现他汀类药物通过增加心脏内皮来源NO生成改善心脏功能的新药理作用，为靶向AP-2α或circRNA-RBCK1的HFpEF药物设计提供思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证circRNA-RBCK1与miR-133a的直接结合
确定circRNA-RBCK1靶向结合的miRNA并验证直接结合
用CircNet预测候选miRNA，采用生物素化circRNA-RBCK1探针pull-down、生物素化miR-133a及其突变体pull-down、双荧光素酶报告基因及FISH共定位验证结合
验证circRNA-RBCK1对miR-133a下游GTPCH1/eNOS信号的功能影响
确定circRNA-RBCK1缺失是否消除洛伐他汀对GTPCH1及eNOS偶联的改善
用慢病毒shRNA敲低circRNA-RBCK1，检测GTPCH1 mRNA、BH4含量、ROS产生和NO水平
验证AP-2α作为circRNA-RBCK1的转录因子
确定他汀类药物上调circRNA-RBCK1转录的转录因子及结合位点
生物信息学筛选转录因子，检测pAP-2α水平和EMSA转录活性，ChIP验证AP-2α与RBCK1启动子结合，双荧光素酶报告基因验证WT/MT启动子活性
验证AP-2α依赖性
确定AP-2α是否为洛伐他汀上调circRNA-RBCK1及改善GTPCH1/BH4/eNOS所必需
用慢病毒AP-2α shRNA敲低AP-2α，检测circRNA-RBCK1、GTPCH1 mRNA、BH4含量、ROS和NO
评估洛伐他汀对HFpEF小鼠舒张功能的作用
确定洛伐他汀在体内是否改善HFpEF表型并上调内皮circRNA-RBCK1信号
HFD+AngII诱导HFpEF雄性小鼠，洛伐他汀预处理后行超声心动图、组织染色、FISH和western blot检测
内皮特异性AP-2α敲除验证体内依赖性
确定内皮AP-2α在洛伐他汀改善HFpEF中的体内作用
构建AP-2αflox/flox/CDH5-Cre-ERT2小鼠，他莫昔芬诱导内皮特异性AP-2α敲除，给予洛伐他汀并诱导HFpEF，检测舒张功能、心脏肥厚、纤维化和circRNA-RBCK1信号
AAV9介导circRNA-RBCK1敲低验证体内依赖性
确定circRNA-RBCK1在洛伐他汀改善HFpEF中的体内作用
尾静脉注射AAV9-circRNA-RBCK1 shRNA敲低circRNA-RBCK1，给予洛伐他汀并诱导HFpEF，检测舒张功能、运动能力、肺重、心脏肥厚纤维化及GTPCH1/BH4
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | AP-2α抗体 | Cell Signaling Technology | 3208 |
| 免疫荧光/Western blot | vWF抗体 | Cell Signaling Technology | 65707 |
| Western blot | GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5173 |
| GTPCH1抗体 | Abcam | ab307507 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG（H+L） | Proteintech | SA00001-1 | |
| 药物处理 | 洛伐他汀 | Sigma-Aldrich | 438186 |
| 普伐他汀 | Sigma-Aldrich | 1554206 | |
| 阿托伐他汀 | Sigma-Aldrich | 524403 | |
| 动物实验 | 血管紧张素II | Sigma-Aldrich | 05-23-0101 |
| ROS检测 | 二氢乙锭 | Sigma-Aldrich | 309800 |
| NO检测 | 二氨基荧光素 | Sigma-Aldrich | D224 |
| 细胞处理 | 氧化型低密度脂蛋白 | Sigma-Aldrich | AB3230 |
| 动物实验 | 高脂饮食 | Research Diet | D12492 |
| EMSA | NE-PER核质提取试剂盒 | PIERCE | 78833 |
| AP-2α试剂盒 | Panomics | AY1002 | |
| ChIP | ChIP-IT试剂盒 | Upstate | 17-295 |
| RNA pull-down | C-1磁珠 | Life Technologies | -- |
| RNA FISH | FISH试剂盒 | RiboBio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞处理与circRNA-RBCK1表达验证 | 洛伐他汀10 μM、普伐他汀20 μM、阿托伐他汀10 μM处理24 h；内皮细胞类型及供体来源 阅读提示：Fig. 1图注及Results第一段 |
| circRNA-RBCK1与miR-133a结合验证 | ox-LDL 100 μg/ml处理24 h；洛伐他汀10 μM预处理2 h；转染质粒及检测方法 阅读提示：Fig. 2图注 |
| circRNA-RBCK1敲低功能验证 | 慢病毒感染48 h；洛伐他汀10 μM加ox-LDL 100 μg/ml处理24 h；每组N=5 阅读提示：Fig. 3图注 |
| AP-2α转录调控验证 | 洛伐他汀10 μM、24 h；ChIP与报告基因实验条件；每组N=5 阅读提示：Fig. 4图注 |
| 体内HFpEF模型建立 | 雄性WT小鼠；HFD+AngII 0.2 mg/kg/day持续12周；洛伐他汀4 mg/kg/day提前1周 阅读提示：Methods中Animals and induction of a 'two-hit' model of HFpEF及Animal experimental protocols |
| 内皮特异性AP-2α敲除实验 | 他莫昔芬2 mg/mouse连续5天；洛伐他汀4 mg/kg/day；HFD+AngII 12周；每组N=10 阅读提示：Fig. 7图注及Animal experimental protocols |
| AAV9介导circRNA-RBCK1敲低实验 | AAV9尾静脉1×10^11 IFU/只，4周后重复；洛伐他汀4 mg/kg/day；HFD+AngII 12周；每组N=11至13 阅读提示：Fig. 8图注及Animal experimental protocols |