CTCF PTM图谱鉴定
以无偏方法系统绘制CTCF从N端到C端的潜在PTM。
从WT mESCs裂解液中纯化CTCF，SDS-PAGE分离、考马斯亮蓝染色后进行LC-MS/MS，Byonic数据库分析原始MS文件，并用O-GlcNAc与精氨酸甲基化抗体富集后LC-MS/MS确认。
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CTCF的PTM图谱揭示O-GlcNAcylation对3D染色质结构的调控
The PTM profiling of CTCF reveals the regulation of 3D chromatin structure by O-GlcNAcylation.
实验完整度
高涵盖mESC体外模型、小鼠多组织样本、LC-MS/MS、ChIP-seq、Hi-C、RNA-seq等多层证据与功能验证
主要模型
小鼠胚胎干细胞（WT_CTCF与MUT_CTCF） CTCF-mAID mESCs 小鼠多种组织样本 MEF、pre-iPSC与mESC
重点核对
CTCF O-GlcNAc位点为T668，T668A突变用于构建O-GlcNAc缺陷型MUT_CTCF 使用0.5 mM auxin处理48 h降解内源CTCF并以相似表达水平外源CTCF替换 ChIP-seq采用spike-in归一化，FDR<0.05判定差异结合 Hi-C鉴定loop domain并分析差异loop domain RNA-seq与GSEA/GO分析发育相关基因表达变化
摘要
CCCTC结合因子（CTCF）是一种广泛表达且高度保守的蛋白，已知在染色质结构中发挥关键作用。翻译后修饰（PTM）使蛋白功能多样化，从而调控众多细胞过程。然而，PTM对CTCF全基因组结合及三维（3D）染色质结构组织的影响尚未被充分理解。在本研究中，我们揭示了CTCF的PTM图谱，并证明CTCF可发生O-GlcNAcylation和精氨酸甲基化。在功能上，我们证明O-GlcNAcylation抑制CTCF与染色质的结合。同时，CTCF O-GlcNAcylation缺陷导致环结构域破坏以及与会细胞发育相关的染色质环改变。此外，CTCF O-GlcNAcylation缺陷增加发育基因的表达，并负向调控干细胞多能性的维持与建立。总之，这些结果为PTM在3D染色质结构中的作用提供了关键见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CTCF存在哪些PTM，以及O-GlcNAcylation如何影响CTCF的全基因组染色质结合与3D染色质结构。
- 核心机制
- CTCF可发生O-GlcNAcylation和精氨酸甲基化，O-GlcNAcylation抑制CTCF与染色质结合；其缺陷增强CTCF结合并改变loop domain及与发育相关的染色质环，进而上调发育基因表达。
- 主要证据
- 通过mESC中LC-MS/MS绘制PTM图谱，结合RL2/sWGA富集与Western blot验证；使用WT_CTCF与T668A MUT_CTCF细胞的ChIP-seq、ATAC-seq、Hi-C和RNA-seq，以及多能性维持与EB分化实验。
- 研究意义
- 为PTM调控3D染色质结构提供分子机制，提示PTM在染色质组织中的重要性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
O-GlcNAcylation与精氨酸甲基化验证
验证CTCF的O-GlcNAcylation与精氨酸甲基化及其调控酶。
在变性条件下用RL2、sWGA富集O-GlcNAc蛋白并以Western blot检测CTCF；纯化CTCF后用RL2检测；T668A突变降低RL2信号；β-hex处理降低信号；用MMA、SDMA、ADMA抗体富集与检测；AdOx处理；检测OGT与CTCF相互作用及Ogt敲低影响。
O-GlcNAc缺陷对CTCF染色质结合的影响
检测O-GlcNAcylation缺失是否改变CTCF全基因组染色质结合与染色质可及性。
在CTCF-mAID mESCs中表达WT_CTCF或T668A MUT_CTCF，auxin降解内源CTCF后进行spike-in归一化ChIP-seq、ATAC-seq及染色质结合/非结合CTCF Western blot。
O-GlcNAc缺陷对3D染色质结构的影响
评估O-GlcNAcylation缺失对A/B区室、TAD与loop domain的影响。
对WT_CTCF与MUT_CTCF mESCs进行in situ Hi-C，分析接触概率、区室、loop domain及CTCF相关loop和E-P互作。
基因表达与多能性功能验证
检测O-GlcNAc缺陷对基因表达、多能性维持、分化与重编程的影响。
进行RNA-seq、GSEA与GO分析；长期培养观察生长曲线、细胞周期、克隆形成与AP染色；EB分化与NPC定向分化；体细胞重编程效率检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证染色质结合与可及性
蛋白互作预测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | SH30022.01 |
| 胎牛血清 | Lonsera | S712-012S | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M6250 | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher | 35050061 | |
| 非必需氨基酸 | Thermo Fisher | 11140050 | |
| 重组白血病抑制因子 | Millipore | -- | |
| 诱导CTCF降解 | 生长素 | Sigma | I5148-2g |
| 细胞转染与筛选 | Fugene HD转染试剂 | Promega | E2311 |
| 细胞筛选 | 潮霉素B | Thermo Fisher | 10687010 |
| NPC分化 | N2添加剂 | Gibco | 17502048 |
| Neurobasal培养基 | Thermo Fisher | 21103049 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| 免疫沉淀 | Protein G琼脂糖 | Roche | 11243233001 |
| O-GlcNAc蛋白富集 | 琼脂糖结合WGA树脂 | Vector Laboratories | AL-1023S |
| 糖苷酶处理 | β-N-乙酰己糖胺酶 | NEB | P0721S |
| 组织蛋白提取 | T-PER组织蛋白提取试剂 | Thermo | 78510 |
| Western blot | PVDF膜 | BIO-RAD | 1620177 |
| ECL底物 | BIO-RAD | 1705061 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | AMERSCO | 0694-1L |
| ChIP-seq | 甲醛 | Sigma | F8775 |
| 甘氨酸 | Sigma | G7126 | |
| 果蝇染色质spike-in | Active Motif | 53083 | |
| 抗CTCF抗体 | Active Motif | 61311 | |
| spike-in抗体 | Active motif | 61686 | |
| RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
| 蛋白酶K | Thermo Fisher | 25530049 | |
| NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 | NEB | E7645 | |
| ATAC-seq | TruePrep DNA文库构建试剂盒V2 | Vazyme | TD501 |
| VAHTS DNA纯化磁珠 | Vazyme | N411 | |
| TruePrep Index试剂盒V2 | Vazyme | TD202 | |
| In situ Hi-C | MboI限制性内切酶 | New England Biolabs | R0147 |
| 生物素-14-dATP | Life Technologies | 19524016 | |
| dCTP | Invitrogen | 18253013 | |
| dGTP | Invitrogen | 18254011 | |
| dTTP | Invitrogen | 18255018 | |
| DNA聚合酶I大片段（Klenow） | New England Biolabs | M0210 | |
| T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | M0202 | |
| MyOne链霉亲和素T1磁珠 | Life technologies | 65602 | |
| T4多核苷酸激酶 | New England Biolabs | M0201 | |
| T4 DNA聚合酶 | New England Biolabs | M0203 | |
| 快速连接酶 | New England Biolabs | M2200 | |
| Illumina索引接头 | New England Biolabs | E7337 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| RNA提取 | RNAzol试剂 | MRC | RN190-500 |
| 流式分析 | Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 |
| 细胞周期流式分析 | DAPI | Sigma | 10236276001 |
| 细胞活力检测 | CCK8细胞计数试剂盒 | DOJINDO | CK04 |
| 克隆形成实验 | 碱性磷酸酶染色试剂 | Yeasen | 40749ES60 |
| Western blot/免疫沉淀 | 抗CTCF抗体 | Abclonal | A19588 |
| O-GlcNAc检测 | 抗RL2抗体 | abcam | ab2739 |
| OGT检测 | 抗OGT抗体 | GeneTex | GTX109939 |
| 精氨酸甲基化检测 | 抗单甲基精氨酸抗体 | CST | 8015 |
| 抗对称二甲基精氨酸抗体 | PTMBIO | PTM-617RM | |
| 抗非对称二甲基精氨酸抗体 | PTMBIO | PTM-605RM | |
| 乙酰化检测 | 抗乙酰赖氨酸抗体 | PTMBIO | PTM-105RM |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Abclonal | AC001 |
| 抗OCT4抗体 | Santa | sc-5279 | |
| 抗SOX2抗体 | Santa | sc-36582-3 | |
| 抗NANOG抗体 | Bethyl | A300-397A | |
| 抗H3抗体 | Santa | sc-17576 | |
| 山羊抗兔IgG(H+L)-HRP二抗 | CST | 7074s | |
| 山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP二抗 | CST | 7076s |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与CTCF替换 | 细胞系R174与CTCF-EGFP-AID ESCs；auxin 0.5 mM处理2天；外源CTCF表达水平需与内源相似 阅读提示：Methods Cell culture；Fig. 3b–d；Supplementary Fig. 3a |
| O-GlcNAc缺陷突变构建 | T668A突变位点；载体pJD105；Fugene HD转染与Hygromycin B筛选 阅读提示：Methods Cell culture；Fig. 2c；Fig. 3a |
| O-GlcNAc与精氨酸甲基化验证 | 变性条件；RL2/sWGA富集；β-hex处理4 μg纯化CTCF；AdOx 30 μM处理36 h 阅读提示：Methods Enrichment与β-hex/AdOx处理；Fig. 2；Supplementary Fig. 2 |
| ChIP-seq与ATAC-seq | spike-in归一化；每种细胞系两个生物学重复；差异结合FDR<0.05 阅读提示：Methods ChIP-seq与ATAC-seq；Fig. 3e–g |
| In situ Hi-C | 每种细胞系三个生物学重复；MboI消化；Hi-C-Pro与ICE归一化 阅读提示：Methods In situ Hi-C与数据分析；Fig. 4；Supplementary Fig. 4 |
| 多能性与分化功能实验 | 克隆形成接种1000细胞培养5天；EB分化无LIF培养；流式细胞周期三个独立重复 阅读提示：Methods Colony formation、EB differentiation、Flow cytometry；Fig. 7 |