三元复合物重构与晶体结构解析
获得纯三元复合物并解析753b介导的VHL/BCL-xL和VHL/BCL-2三元复合物结构。
将VCB、BCL-xL或BCL-2与753b混合，经凝胶过滤纯化三元复合物，浓缩后进行结晶筛选和优化，收集X射线衍射数据并解析结构。
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高效第二代 BCL-2 和 BCL-xL 双降解剂的开发及其晶体结构
Development and crystal structures of a potent second-generation dual degrader of BCL-2 and BCL-xL.
实验完整度
高包含晶体结构解析、体外泛素化、AlphaScreen/AlphaLISA/NanoBRET及细胞降解、增殖等相互独立的功能与机制验证
主要模型
VCB（VHL-Elongin C-Elongin B）重组蛋白复合物 BCL-xL（aa 2-212）和BCL-2（aa 1-207）重组蛋白 Jurkat细胞 HeLa HiBiT-BCL-xL/BCL-2敲入细胞
重点核对
三元复合物晶体结构分辨率：BCL-2/753b为2.56 Å、BCL-xL/753b为2.94 Å、BCL-2/WH244为2.98 Å 体外泛素化实验使用BCL-xL/BCL-2（5 μM）、E1 SpUba1（0.1 μM）、UbcH5c（1 μM）、Cdc34（1 μM）、泛素（75 μM）、VCB（0.35 μM）、neddylated Cullin2-Rbx1（0.35 μM）和753b或WH244（10 μM） Jurkat细胞中WH244和753b处理16 h后免疫印迹检测BCL-xL/BCL-2降解，DC50分别为0.6/7.4 nM和3.7/50 nM AlphaLISA三元复合物实验使用6×His-BCL-xL（100 nM）或BCL-2（150 nM）、GST-VCB（100 nM） NanoBRET细胞三元复合物实验使用293T细胞转染HaloTag-VHL、HiBiT-BCL-xL/BCL-2和LgBiT，MG132（10 μM）预处理2 h，化合物处理4 h
摘要
BCL-xL 和 BCL-2 的过表达在肿瘤发生和癌症耐药中发挥关键作用。PROTAC 技术的进展促进了首个 BCL-xL/BCL-2 双降解剂 753b 的近期开发，这是一种基于 VHL 的降解剂，与以往的小分子抑制剂相比具有更强的效力和更低的毒性。在本研究中，我们测定了 VHL/753b/BCL-xL 和 VHL/753b/BCL-2 三元复合物的晶体结构。这两个三元复合物表现出显著不同的结构，并伴随着 VHL/753b 连接子/靶标界面上不同的相互作用网络。这些界面接触的重要性通过功能分析得到验证，并为后续针对 753b 连接子和 BCL-2/BCL-xL 弹头的合理及结构导向设计提供了依据。这导致设计出一种降解剂 WH244，其在细胞中降解 BCL-xL/BCL-2 的效力增强。通过生物物理测定及随后的细胞活性研究，我们能够解释细胞中 BCL-xL/BCL-2 靶标降解增强的原因。大多数 PROTAC 是经验性设计的，缺乏结构研究，使得理解其作用模式和特异性具有挑战性。我们的工作提出了一种简化的方法，结合合理设计和基于结构的见解，并以细胞研究为支撑，来开发有效的基于 PROTAC 的癌症治疗药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 753b介导BCL-xL/BCL-2靶向降解的分子基础是什么，以及能否利用该结构信息设计更高效的降解剂。
- 核心机制
- 753b通过其连接子与VHL和BCL-xL/BCL-2形成不同的三元复合物界面相互作用网络；基于结构将753b的柔性烷基链替换为1,4-二甲基哌嗪并采用桥联吗啉弹头，使WH244形成更稳固的二元结合和更强的三元复合物，从而增强降解效力。
- 主要证据
- 解析了VCB/753b/BCL-xL、VCB/753b/BCL-2和VCB/WH244/BCL-2晶体结构；通过界面残基突变体的体外多聚泛素化实验和AlphaLISA验证界面接触；在Jurkat和HeLa HiBiT敲入细胞中验证WH244比753b更高效降解BCL-xL/BCL-2。
- 研究意义
- 本研究提供了将合理设计与结构见解相结合并以细胞研究支撑的PROTAC开发范例，为推进WH244作为BCL-xL/BCL-2双降解剂用于癌症治疗奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
界面残基突变与体外多聚泛素化功能验证
验证晶体结构中观察到的三元复合物界面接触对泛素化的功能重要性。
基于结构设计BCL-2和BCL-xL界面残基突变体，在体外重构泛素化反应体系，检测753b或WH244存在下靶蛋白的多聚泛素链形成。
二元结合与三元复合物形成检测
确认界面突变体活性丧失源于界面破坏而非二元结合或三元复合物形成缺陷。
使用AlphaScreen置换实验检测化合物与BCL-2/BCL-xL的二元结合亲和力，使用AlphaLISA检测VCB/PROTAC/BCL-xL或BCL-2三元复合物形成。
结构导向设计WH244并评估细胞降解活性
基于三元结构改造连接子和弹头，获得更高效的双降解剂并验证其细胞降解活性和机制依赖性。
将753b的烷基链替换为1,4-二甲基哌嗪连接子，将吗啉替换为桥联吗啉，得到WH244；在Jurkat细胞中免疫印迹检测降解，并检测时间进程、可逆性、通路依赖性及对细胞增殖的影响。
HiBiT降解动力学与细胞三元复合物形成
比较WH244和753b诱导BCL-xL/BCL-2降解的效率和三元复合物形成能力。
使用CRISPR-Cas9构建内源性HiBiT-BCL-xL/BCL-2 HeLa细胞，进行剂量和时程降解实验；在293T细胞中使用NanoBRET检测细胞内三元复合物形成。
WH244三元复合物晶体结构解析
解析WH244介导的VHL/BCL-2三元复合物结构，阐明其增强效力的结构基础。
使用与753b三元复合物相同的凝胶过滤纯化策略获得VCB/WH244/BCL-2复合物，进行结晶、衍射数据收集和结构解析。
蛋白质组学评估靶标选择性和脱靶效应
无偏评估753b和WH244对蛋白质组的影响及脱靶效应。
Jurkat细胞用DMSO、100 nM 753b或100 nM WH244处理8 h后进行TMT标记质谱；HeLa细胞进行DIA蛋白质组学分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12430054 |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 22400–089 | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Boston Bio Products | BP-115DG |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | PPC1010 | |
| Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 4× Laemmli SDS上样缓冲液 | Boston Bio Products | BP-110R | |
| Mini-PROTEAN TGX预制4–20% Tris-甘氨酸凝胶 | Bio-Rad | 456–1094 | |
| PVDF印迹膜（0.2 μm孔径） | Thermo Fisher Scientific | LC2002 | |
| BCL-xL抗体 | Cell Signaling Technologies | 2762S | |
| BCL-2抗体 | Cell Signaling Technologies | 2870S | |
| β-肌动蛋白抗体 | MP Biomedicals | 8691001 | |
| 体外泛素化免疫印迹 | BCL-xL抗体 | Santa Cruz | sc-8392 |
| BCL-2抗体 | Santa Cruz | sc-7832 | |
| AlphaScreen结合实验 | 抗6×His受体珠 | PerkinElmer | AL128M |
| 链霉亲和素供体珠 | PerkinElmer | 6760002 | |
| AlphaScreen/AlphaLISA | 384孔白色OptiPlate | PerkinElmer | 6008280 |
| AlphaLISA三元复合物实验 | Alpha谷胱甘肽供体珠 | PerkinElmer | 6765300 |
| 细胞活力实验 | MTS试剂 | Promega | G1111 |
| HiBiT降解实验 | Nano-Glo® HiBiT裂解检测系统 | Promega | N3040 |
| 热迁移实验 | GloMelt热迁移蛋白稳定试剂盒 | Biotium | -- |
| 蛋白质组学 | 测序级修饰猪胰蛋白酶 | Promega | V5111 |
| TMT蛋白质组学 | 串联质谱标签同量异位标记试剂 | Thermo Fisher | A34808 |
| NanoBRET实验 | HaloTag-VHL质粒 | Promega | CS1679C155 |
| CMV HiBiT质粒 | Promega | CS1956B03 | |
| HaloTag NanoBRET 618配体 | Promega | PRN1662 | |
| NanoBRET Nano-Glo底物 | Promega | N1662 | |
| Gibco™ Opti-MEM™ I减血清培养基（无酚红） | Fisher | 11-058-021 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 三元复合物结晶 | VCB:BCL-xL:753b摩尔比1:1:3、室温孵育30 min、凝胶过滤纯化、蛋白浓度14-16 mg/ml；VCB/BCL-2/753b约10-12 mg/ml；VCB/BCL-2/WH244 11-14 mg/ml 阅读提示：Methods中Crystallization and data collection小节 |
| 体外多聚泛素化实验 | BCL-xL/BCL-2 5 μM、E1 SpUba1 0.1 μM、UbcH5c 1 μM、Cdc34 1 μM、泛素75 μM、VCB 0.35 μM、neddylated Cullin2-Rbx1 0.35 μM、753b或WH244 10 μM、37 °C；突变体固定1 h 阅读提示：Methods中Polyubiquitin chain formation assay小节及Supplementary Fig. 4 |
| AlphaScreen二元结合实验 | Biotin-Bim或Biotin-Bad浓度（WT 15 nM，突变体50 nM）、6×His-BCL-2 WT 25 nM/突变体50 nM、6×His-BCL-xL WT 10 nM/突变体50 nM、供受体珠浓度160 μg/mL 阅读提示：Methods中Binary binding affinities小节及Supplementary Fig. 7 |
| AlphaLISA三元复合物实验 | 6×His-BCL-xL 100 nM或BCL-2 150 nM、GST-VCB 100 nM、供受体珠160 μg/mL、室温孵育15 min和45 min 阅读提示：Methods中AlphaLISA ternary complex assay小节及Fig. 2c/f、Fig. 4e/f |
| Jurkat细胞降解实验 | 化合物处理16 h（浓度曲线）、0.1 μM WH244时程、ABT263/VHL-L预处理2 h后WH244处理6 h、MG132/MLN4924处理；DC50值0.6/7.4 nM（WH244）和3.7/50 nM（753b） 阅读提示：Fig. 3b–f图注及Results相关段落 |
| HiBiT降解实验 | HeLa HiBiT-BCL-xL/BCL-2细胞2×10^4/孔、化合物处理6 h（剂量曲线）或不同时间点（时程）；100 nM和10 nM剂量 阅读提示：Methods中HiBiT degradation assay小节及Fig. 4a–d |
| NanoBRET细胞三元复合物实验 | 293T细胞转染HaloTag-VHL（1 μg）、HiBiT-BCL-xL/BCL-2（20 ng）、LgBiT（20 ng）；MG132（10 μM）预处理2 h；化合物处理4 h；HaloTag NanoBRET 618配体 阅读提示：Methods中NanoBRET ternary complex formation assay小节及Fig. 4g/h |