患者队列遗传筛选
识别ALS相关的罕见致病变异
对154例sALS和102例对照进行WES，发现候选基因后设计288基因面板，在392例ALS和328例对照中进行超深度靶向测序，筛选双等位基因罕见致病变异，并通过Sanger测序在额外队列中验证。
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PCDHA9作为肌萎缩侧索硬化症的候选基因
PCDHA9 as a candidate gene for amyotrophic lateral sclerosis.
实验完整度
高含患者外显子组/靶向测序、两种突变小鼠模型、行为学、病理、EMG、多组学及体外功能验证
主要模型
中国散发性ALS患者队列 Pcdha9 L729P点突变纯合小鼠 Pcdha9 M723Wfs缺失突变纯合小鼠 HEK293细胞
重点核对
患者队列：154例sALS和102例对照进行WES，392例ALS和328例对照进行靶向测序 小鼠模型：CRISPR/Cas9构建Pcdha9 L729P和M723Wfs纯合突变，C57BL/6背景 行为学：12月龄突变小鼠进行足迹、握力、转棒和游泳测试 病理检测：12-14月龄小鼠脊髓运动神经元计数、NMJ染色和TDP-43免疫染色 多组学：9月龄小鼠脊髓腹角snRNA-seq和snATAC-seq
摘要
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种毁灭性的神经退行性疾病。为了识别额外的遗传因素，我们分析了一个大型中国ALS患者队列的外显子组序列，发现三个无亲缘关系的患者中PCDHA9存在纯合变异（p.L700P）。我们构建了携带直系同源点突变或缺失突变的Pcdhα9突变小鼠。这些小鼠出现进行性脊髓运动神经元丢失、肌肉萎缩以及神经肌肉接头的结构/功能异常，导致瘫痪和早期死亡。在老年突变小鼠的脊髓运动神经元中检测到TDP-43病理。在机制上，我们证明Pcdha9突变导致衰老脊髓中FAK和PYK2的异常激活，并显著降低运动神经元中NKA-α1的表达。我们的单核多组学分析揭示了老年突变小鼠中参与细胞粘附、离子转运、突触组织和神经元存活的信号通路受到干扰。总之，我们的结果提出PCDHA9是一个潜在的ALS基因，并为其发病机制提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PCDHA9是否为ALS的候选基因，及其突变如何导致ALS发病？
- 核心机制
- PCDHA9 L700P突变导致蛋白不稳定和膜表达降低，异常激活FAK和PYK2，并降低运动神经元中NKA-α1表达，干扰细胞粘附、离子转运和突触组织，导致运动神经元变性。
- 主要证据
- 在3例无关ALS患者中检测到PCDHA9纯合L700P变异；Pcdhα9点突变和缺失小鼠均出现进行性运动缺陷、神经源性肌萎缩、脊髓运动神经元丢失、NMJ异常和TDP-43病理；体外实验显示突变体PCDHA9不稳定、不能抑制FAK/PYK2磷酸化；多组学分析显示相关信号通路失调。
- 研究意义
- 提出PCDHA9是潜在的ALS基因，并提供了其发病机制的见解，Pcdhα9突变小鼠可作为ALS相关模型用于机制研究和治疗测试。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠模型构建与鉴定
建立Pcdha9突变小鼠以验证致病性
利用CRISPR/Cas9构建Pcdha9 L729P点突变和M723Wfs缺失突变纯合小鼠，通过测序和qPCR鉴定基因型及mRNA表达。
运动功能与生存分析
评估突变小鼠是否出现ALS样运动缺陷
对突变小鼠进行生存分析、足迹测试、握力测试、转棒测试和游泳测试，监测体重和瘫痪表型。
神经肌肉病理分析
检测运动神经元丢失、肌肉萎缩和NMJ异常
对腓肠肌进行称重和H&E染色，脊髓切片进行CHAT、GFAP、NeuN、TDP-43免疫染色，NMJ进行α-BTX和NF-200染色，坐骨神经进行甲苯胺蓝染色和EMG检测。
体外机制验证
探究L700P突变对PCDHA9蛋白稳定性及FAK/PYK2信号的影响
在HEK293细胞中转染WT或突变hPCDHA9，用CHX和MG132处理检测蛋白稳定性，通过免疫共沉淀和Western blot检测与FAK/PYK2的相互作用及磷酸化水平。
多组学分析
揭示突变小鼠脊髓腹角的转录和表观遗传改变
对9月龄WT和Mut小鼠脊髓腹角进行snRNA-seq和snATAC-seq，分析差异表达基因、差异可及区域、基因调控网络和细胞间通讯。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 全外显子组测序 | Agilent SureSelect QXT 全人类外显子V6试剂盒（64MB） | Agilent | -- |
| Illumina Hiseq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| 靶向测序 | TruSeq DNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| TargetSeqTM液相芯片捕获测序试剂盒 | iGeneTech | -- | |
| Illumina Hiseq X-ten测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞培养与处理 | VigoFect转染试剂 | Vigorous | -- |
| 细胞处理 | MG132蛋白酶体抑制剂 | Tocris bioscience | 1748 |
| 免疫荧光 | 抗CHAT抗体 | Abcam | ab178850 |
| 抗GFAP抗体 | Dako | Z0334 | |
| 抗NeuN抗体 | Abcam | ab104224 | |
| 抗Na+/K+ ATP酶-α1抗体 | Abcam | ab76020 | |
| 抗NKA-α1抗体 | Abcam | ab7671 | |
| 抗TDP43抗体 | Abcam | ab237270 | |
| 抗PCDHA9抗体 | Proteintech | 18075-1-AP | |
| Western blot | 抗磷酸化FAK抗体 | CST | 3283 |
| 抗磷酸化PYK2抗体 | CST | 3291S | |
| 抗Flag抗体 | MBL | M185 | |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab13970 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | CST | 3873 | |
| NMJ染色 | α-银环蛇毒素-Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | B13423 |
| 抗神经丝蛋白200抗体 | Sigma | N4142 | |
| RNAscope | CHAT探针 | ACD | 408731 |
| PCDHA9探针 | ACD | 540581-C2 | |
| snRNA-seq | Chromium单细胞3′ GEM、文库和凝胶珠试剂盒V3.1 | 10x Genomics | 1000075 |
| Chromium单细胞B芯片试剂盒 | 10x Genomics | 1000074 | |
| snATAC-seq | Chromium单细胞ATAC试剂盒 | 10x Genomics | PN-1000110 |
| 蛋白质组学 | Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者遗传筛选 | WES和靶向测序的样本量、纳入排除标准、测序深度和变异筛选标准 阅读提示：Methods中Study participants和Whole-exome sequencing小节，以及Tab. S1-S7 |
| 小鼠模型构建 | 突变位点、遗传背景、繁育方式、基因型鉴定引物 阅读提示：Methods中Generation of Pcdhα9 point mutation and deletion mice小节和图S1 |
| 行为学测试 | 测试月龄、性别、测试顺序、每组样本量、统计方法 阅读提示：Methods中Behavioral tests小节和图2及图S2、S3 |
| 神经肌肉病理 | 取组织月龄、抗体稀释比例、切片厚度、计数方法 阅读提示：Methods中Immunohistochemistry and immunofluorescence analysis、Isolation and characterization of NMJs小节和图3、4 |
| 多组学分析 | 小鼠月龄、核分离方法、测序平台、数据分析参数 阅读提示：Methods中Nuclei isolation、Single nuclei RNA-seq and single nuclei ATAC-seq library preparation and sequencing小节和图8 |