代谢小分子化合物筛选
筛选能抑制胶质瘤细胞诱导的巨噬细胞迁移的脑渗透性代谢化合物。
用55种代谢重编程小分子化合物（10 μM）处理CT2A细胞，收集条件培养基进行Raw264.7迁移实验；对24种有效化合物在5 μM下进行第二轮筛选。
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乳酸脱氢酶A调控肿瘤-巨噬细胞共生以促进胶质母细胞瘤进展
Lactate dehydrogenase A regulates tumor-macrophage symbiosis to promote glioblastoma progression.
实验完整度
高含体外细胞系、原代巨噬细胞、GSC、小鼠原位模型、PDX及患者样本多层级，并有遗传与药理功能验证
主要模型
小鼠胶质瘤细胞系CT2A和GL261 人胶质瘤干细胞GSC272与小鼠005 GSC C57BL/6及裸鼠颅内原位移植瘤模型 胶质母细胞瘤患者肿瘤与血浆样本
重点核对
LDHA敲低（shLdha）或抑制剂stiripentol（10 μM）、FX11（8 μM）处理后CM对巨噬细胞迁移的影响 2-DG（10 mM）处理胶质瘤细胞后CM对Raw264.7、BMDM、THP-1迁移的影响 CCL2/CCL7重组蛋白（10 ng/ml）及shCcl2/shCcl7对巨噬细胞迁移的作用 stiripentol 150 mg/kg腹腔注射隔日给药对原位荷瘤小鼠生存的影响 YAP1/STAT3 ChIP-PCR与verteporfin（1 μM）、WP1066（10 μM）对CCL2/CCL7的调控
摘要
巨噬细胞大量浸润和肿瘤代谢改变是胶质母细胞瘤的两个关键特征。通过对一组代谢小分子化合物进行筛选，我们发现抑制胶质母细胞瘤细胞糖酵解可削弱巨噬细胞迁移，乳酸脱氢酶抑制剂司替戊醇（stiripentol）成为最显著的候选物。联合谱分析和功能研究表明，乳酸脱氢酶A（LDHA）导向的细胞外信号调节激酶（ERK）通路激活胶质母细胞瘤细胞中的yes相关蛋白1（YAP1）/信号转导与转录激活因子3（STAT3）转录共激活因子，上调C-C基序趋化因子配体2（CCL2）和CCL7，从而将巨噬细胞招募至肿瘤微环境。反过来，浸润的巨噬细胞产生含LDHA的细胞外囊泡，促进胶质母细胞瘤细胞糖酵解、增殖和存活。遗传学和药理学抑制LDHA介导的肿瘤-巨噬细胞共生可显著抑制胶质母细胞瘤小鼠模型中的肿瘤进展和巨噬细胞浸润。对胶质母细胞瘤患者肿瘤和血浆样本的分析证实，LDHA及其下游信号是潜在的生物标志物，与巨噬细胞密度呈正相关。因此，LDHA介导的肿瘤-巨噬细胞共生为胶质母细胞瘤提供了治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胶质母细胞瘤细胞糖酵解是否以及如何影响巨噬细胞浸润，以及浸润巨噬细胞是否反过来促进肿瘤进展。
- 核心机制
- LDHA/乳酸导向的ERK通路激活YAP1和STAT3转录共激活因子，上调CCL2和CCL7招募巨噬细胞；巨噬细胞通过含LDHA的细胞外囊泡回馈促进胶质瘤细胞糖酵解、增殖和存活，形成肿瘤-巨噬细胞共生正反馈。
- 主要证据
- 体外多种胶质瘤细胞系与GSC的条件培养基迁移实验、shRNA与LDHA抑制剂处理、ChIP-PCR与免疫印迹；小鼠原位移植瘤和PDX模型的生存分析、流式与免疫荧光；患者肿瘤与血浆样本的相关性分析。
- 研究意义
- LDHA介导的肿瘤-巨噬细胞共生为胶质母细胞瘤提供治疗靶点，LDHA及其下游信号可能作为与巨噬细胞密度正相关的潜在生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
糖酵解与LDHA对巨噬细胞迁移的验证
验证胶质瘤细胞糖酵解及LDHA在触发巨噬细胞迁移中的作用。
用2-DG、stiripentol、FX11处理或shLdha敲低CT2A、GL261、GSC272、005 GSC，收集CM进行transwell和划痕实验，检测多种巨噬细胞迁移。
LDHA下游趋化因子鉴定
确定LDHA调控的介导巨噬细胞招募的趋化因子。
结合RNA-seq、TCGA数据与分泌蛋白数据集筛选候选基因，用RT-qPCR、ELISA和重组蛋白验证CCL2和CCL7。
YAP1/STAT3机制验证
阐明LDHA调控CCL2/CCL7的转录机制。
GSEA筛选通路，免疫印迹检测P-ERK、YAP1、P-STAT3，使用ravoxertinib、verteporfin、WP1066及ChIP-PCR验证YAP1/STAT3与Ccl2/Ccl7启动子结合。
巨噬细胞来源EVs回馈验证
验证巨噬细胞通过含LDHA的EVs促进胶质瘤细胞糖酵解和存活。
用胶质瘤CM教育巨噬细胞（EMφ），分离EVs，检测LDHA传递、ECAR、细胞周期、凋亡及ERK-YAP1/STAT3-CCL2/CCL7信号。
体内药理学与遗传学验证
评估抑制LDHA介导的共生对肿瘤生长、巨噬细胞浸润和生存的影响。
原位移植shLdha或对照细胞，使用stiripentol、isosafrole、BLZ945、WP1066处理，建立PDX及LDHA-mKO小鼠，检测生存、巨噬细胞和信号。
患者样本临床相关性分析
验证LDHA-YAP1/STAT3-CCL2/CCL7轴与患者巨噬细胞密度的关系。
对30例胶质母细胞瘤肿瘤进行LDHA与Mac-2免疫荧光，检测54例患者血浆LDHA、CCL2、CCL7及血浆EVs中LDHA。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 司替戊醇 | MCE MedChemExpress | HY-103392 |
| BLZ945 | Selleck Chemicals | S7725 | |
| WP1066 | Selleck Chemicals | S2796 | |
| 立体定位仪 | RWD Life Science | 68513 | |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | 11995-065 |
| 胎牛血清 | Fisher Scientific | 16140071 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM-Ham's F12培养基 | Gibco | 10565-018 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 22400-089 | |
| 神经干细胞增殖培养基 | Millipore | SCM005 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | PeproTech | 100-18B | |
| 表皮生长因子 | PeproTech | AF-100-15 | |
| 原代BMDM分离 | Ficoll密度梯度分离液 | Sigma Aldrich | 17-5442-02 |
| CD34磁珠 | Miltenyi | 130-100-453 | |
| 质粒转染 | 聚凝胺 | Millipore | TR-1003-G |
| 嘌呤霉素 | Millipore | 540411 | |
| 迁移实验 | Transwell小室 | Corning | 07-200-149 |
| 结晶紫 | Sigma | C-3886 | |
| 代谢化合物筛选 | 中枢神经系统渗透性化合物库 | MCE MedChemExpress | HY-L028 |
| 代谢检测 | 糖酵解检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK439 |
| Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent Technologies | 103015-100 | |
| ELISA | 人LDHA检测试剂盒 | Biomatik | EKE60382 |
| 人CCL2检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | RAB0054 | |
| 人CCL7检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | RAB0078 | |
| 小鼠CCL2检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | RAB0055 | |
| 小鼠CCL7检测试剂盒 | Invitrogen | BMS6006INST | |
| EV分离 | SmartSEC单细胞外囊泡分离系统 | System Biosciences | SSEC200A-1 |
| EV内化 | DiD荧光染料 | Biotium | 60014 |
| 免疫荧光 | DAPI抗淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1200-10 |
| 流式分析 | 可固定活力染料 | Invitrogen | 5211229035 |
| CD63外泌体捕获磁珠 | Abcam | ab239686 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Thermo Fisher | 89901 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Millipore | 11697498001 | |
| SDS-PAGE凝胶 | GenScript | M00652 | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 1704270 | |
| LDHA抗体 | CST | 2012 | |
| YAP1抗体 | CST | 14074 S | |
| 磷酸化STAT3抗体 | CST | 9145 S | |
| RT-qPCR | RNeasy微型RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| SYBR Green PCR预混液 | Bio-Rad | 1725275 | |
| ChIP-PCR | Pierce磁珠染色质免疫沉淀试剂盒 | ThermoFisher | 26157 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 代谢化合物筛选 | 化合物浓度（初筛10 μM、复筛5 μM）、处理及CM收集时间、Raw264.7迁移实验重复数 阅读提示：Results 第1节及 Fig. 1d, e；Methods 'Metabolic compound screen' |
| 巨噬细胞迁移实验 | 巨噬细胞接种数量（Raw264.7与BMDM 1×10^4，THP-1 5×10^5）、迁移时间（8或16小时）、Transwell孔径5.0 μm 阅读提示：Methods 'Migration assay' 及 Fig. 1、Fig. 2、Fig. 3 图注 |
| LDHA抑制剂处理 | stiripentol 10 μM、FX11 8 μM、2-DG 10 mM的处理时长与CM收集流程 阅读提示：Results 第2节及 Fig. 2、Fig. 3 图注；Methods 'Cell culture' CM收集描述 |
| YAP1/STAT3机制验证 | verteporfin 1 μM、WP1066 10 μM、ravoxertinib浓度（文中未明确说明）、ChIP-PCR样本数n=4 阅读提示：Results 第4节及 Fig. 4 图注；Methods 'ChIP-PCR' |
| 体内药理实验 | stiripentol 150 mg/kg i.p.隔日给药起始天数与剂量数、BLZ945 200 mg/kg、WP1066 60 mg/kg、每组小鼠数量 阅读提示：Methods 'Mice and intracranial xenograft tumor models' 及 Fig. 6、Supplementary Fig. S13 图注 |
| 患者样本分析 | 肿瘤样本n=30、血浆胶质母细胞瘤n=54、脑膜瘤n=15、健康对照n=10及纳入标准 阅读提示：Methods 'Patient samples' 及 Fig. 7 图注 |