MYC表达与CDK4/6i敏感性及pRB1水平关联分析
验证高MYC表达是否导致CDK4/6i耐药并伴随pRB1蛋白降低。
在膀胱、前列腺和乳腺癌细胞系中检测MYC和pRB1蛋白水平，用palbociclib处理检测细胞活力和集落形成，并利用mini-PDX模型评估palbociclib敏感性。
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MYC通过促进pRB1降解诱导CDK4/6抑制剂耐药
MYC induces CDK4/6 inhibitors resistance by promoting pRB1 degradation.
实验完整度
高包含多种癌细胞系体外模型、mini-PDX、异种移植瘤小鼠模型及患者组织芯片，并进行功能与机制验证
主要模型
膀胱癌细胞系T24和UMUC14 前列腺癌细胞系C4-2 乳腺癌细胞系MDA-MB-231 T24和UMUC14异种移植瘤小鼠模型 乳腺癌组织mini-PDX模型
重点核对
MYC过表达或敲低对pRB1蛋白水平及palbociclib敏感性的影响 KLHL42敲低对pRB1泛素化、半衰期及CDK4/6i敏感性的影响 A80.2HCl在2-50 nM浓度下降解MYC并恢复pRB1蛋白水平 A80.2HCl与palbociclib联合在T24和UMUC14异种移植瘤中的肿瘤生长抑制
摘要
CDK4/6抑制剂（CDK4/6i）在部分人类恶性肿瘤（如乳腺癌）中显示出抗癌活性。然而，其在其他肿瘤类型中的应用及内在耐药机制仍不清楚。在此，我们证明MYC扩增赋予膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌细胞对CDK4/6i的耐药性。机制上，MYC结合E3泛素连接酶KLHL42的启动子并增强其转录，通过诱导磷酸化和总pRB1的泛素化及降解导致RB1缺陷。我们发现一种降解MYC的化合物A80.2HCl，可在纳摩尔浓度下降解MYC，恢复pRB1蛋白水平并重建高表达MYC的癌细胞对CDK4/6i的敏感性。CDK4/6i与A80.2HCl联合在体内导致肿瘤生长显著消退。总之，这些结果揭示了MYC诱导CDK4/6i耐药的分子机制，并提示利用MYC降解分子A80.2HCl增强CDK4/6i的治疗疗效。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MYC扩增是否以及如何导致肿瘤细胞对CDK4/6抑制剂耐药，以及能否通过靶向MYC克服耐药。
- 核心机制
- MYC结合KLHL42启动子并增强其转录，KLHL42作为E3泛素连接酶促进pRB1泛素化和蛋白酶体降解，导致pRB1蛋白缺陷，从而介导CDK4/6i耐药。
- 主要证据
- 在膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌细胞系中过表达或敲低MYC改变pRB1蛋白水平和palbociclib敏感性；KLHL42敲低恢复pRB1并增加CDK4/6i敏感性；A80.2HCl降解MYC、恢复pRB1并与palbociclib协同抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示了MYC诱导CDK4/6i耐药的分子机制，并提示MYC降解分子A80.2HCl可增强CDK4/6i的治疗疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MYC过表达或敲低对pRB1蛋白及CDK4/6i敏感性的影响
验证MYC表达变化是否直接改变pRB1蛋白丰度和CDK4/6i敏感性。
在T24、C4-2和MDA-MB-231细胞中过表达MYC，在T24和UMUC14细胞中敲低MYC，检测pRB1蛋白、RB1 mRNA、细胞活力和集落形成，并在T24异种移植瘤中检测palbociclib敏感性。
MYC通过蛋白酶体途径促进pRB1降解的验证
验证MYC是否在转录后水平通过蛋白酶体降解降低pRB1蛋白。
在293T细胞中转染MYC并检测pRB1蛋白和RB1 mRNA，使用MG132处理，在T24和UMUC14细胞中敲低MYC后检测pRB1半衰期和泛素化，并在膀胱癌组织芯片中分析MYC与pRB1相关性。
KLHL42与pRB1相互作用及泛素化降解验证
确定KLHL42是否为介导pRB1泛素化和降解的E3泛素连接酶。
通过LC-MS筛选与pRB1相互作用的蛋白，co-IP和GST pull-down验证KLHL42与pRB1结合及结构域，敲低或过表达KLHL42检测pRB1蛋白、泛素化和半衰期，并在组织芯片中分析KLHL42与pRB1相关性。
MYC转录调控KLHL42的验证
验证KLHL42是否为MYC的直接转录靶标。
利用ChIP-seq数据集分析MYC在KLHL42启动子的结合，ChIP-qPCR验证结合，敲低MYC检测KLHL42 mRNA和蛋白水平，并在High Myc转基因小鼠前列腺标本中检测Myc、Klhl42和Rb1表达。
KLHL42在MYC介导的CDK4/6i耐药中的功能验证
验证KLHL42敲低是否逆转MYC诱导的CDK4/6i耐药。
在T24和UMUC14细胞中单独或联合敲低MYC和KLHL42，用palbociclib处理，检测集落形成和细胞活力。
A80.2HCl的鉴定及其降解MYC的机制验证
鉴定能降解MYC的化合物并验证其作用机制。
从177个酰亚胺类化合物库中筛选，在HL60细胞中鉴定A80.2HCl，通过ITC和HTRF检测与MYC和CRBN的结合，co-IP检测CRBN-MYC结合，在多种癌细胞系中检测MYC、KLHL42和pRB1蛋白变化，并用CRBN敲除验证依赖性。
A80.2HCl联合CDK4/6i的体外和体内疗效评估
评估A80.2HCl与palbociclib联合是否协同克服CDK4/6i耐药。
在T24和UMUC14细胞中检测联合用药对细胞活力和集落形成的影响，利用compuSyn分析协同作用，在T24和UMUC14异种移植瘤及MYC扩增的乳腺癌mini-PDX模型中评估联合疗效。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | -- |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| Western blot | RB抗体 | Cell Signaling Technology | 9309 |
| RB抗体 | Cell Signaling Technology | 9313 | |
| E2F1抗体 | Proteintech | 66515-1-Ig | |
| 磷酸化Rb (Ser795)抗体 | Cell Signaling Technology | 9301S | |
| RBL1抗体 | Proteintech | 13354-1-AP | |
| RBL2抗体 | Proteintech | 27251-1-AP | |
| Cyclin B1抗体 | ABclonal | A19037 | |
| RNF40抗体 | ABclonal | A6443 | |
| LRPPRC抗体 | ABclonal | A3365 | |
| CDK4抗体 | ABclonal | A11136 | |
| CDK6抗体 | ABclonal | A0106 | |
| KATNA1抗体 | ABclonal | A16491 | |
| c-MYC抗体 | ABclonal | A1309 | |
| KLHL42抗体 | Invitrogen | PAS-54292 | |
| Vinculin抗体 | Santa Cruz | sc-73614 | |
| β-Actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| Myc抗体 | Santa Cruz | sc-40 | |
| HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| Flag抗体 | MBL | M185-7 | |
| 兔IgG | ABclonal | AS014 | |
| 鼠IgG | ABclonal | AS003 | |
| 免疫沉淀 | protein A/G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| HA偶联琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Flag偶联琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 体内泛素化实验 | MG132 | -- | -- |
| RT-qPCR | RNAfast200试剂盒 | Fastagen | -- |
| PrimeScript RT Master Mix | TAKARA | RR036A | |
| 2×TSINGKE® Master qPCR Mix (SYBR Green I) | TSINGKE | -- | |
| CFX96检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| mini-PDX模型 | OncoVee®胶囊 | LIDE Biotech | -- |
| CellTiter Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7571 | |
| 异种移植瘤模型 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| 细胞活力检测 | 甲基噻唑四氮唑盐（MTT） | Sigma Aldrich | -- |
| Epoch酶标仪 | BioTek | -- | |
| 质谱分析 | 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | PRV5111 |
| 纳流EASY-nLC 1200系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Orbitrap Exploris480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Illumina TruSeq链特异性总RNA/Ribo-Zero样本制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| FlashPAGE变性PAGE分级分离仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | ECL蛋白质印迹底物 | Bio-Rad | -- |
| 免疫组化 | Leica SCN400显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MYC过表达与CDK4/6i敏感性 | MYC过表达细胞系（T24、C4-2、MDA-MB-231）、palbociclib处理浓度和时间、集落形成实验重复数（n=3） 阅读提示：Methods细胞培养与转染部分、Fig. 1g图注 |
| MYC调控pRB1降解 | MG132处理浓度20 μM和6小时、CHX处理浓度200 μg/μl、细胞系（293T、T24、UMUC14） 阅读提示：Methods免疫沉淀与免疫印迹部分、Fig. 2a和2e图注 |
| KLHL42与pRB1相互作用 | KLHL42敲低细胞系（T24、UMUC14）、CHX处理浓度200 μg/μl、IP实验条件 阅读提示：Methods免疫沉淀与免疫印迹部分、Fig. 3l图注 |
| MYC转录调控KLHL42 | ChIP-qPCR细胞系（T24、UMUC14）、High Myc转基因小鼠分组（Pbsn-cre n=5，Hi-Myc肿瘤n=8） 阅读提示：Methods染色质免疫沉淀部分、Fig. 4b和4f图注 |
| A80.2HCl鉴定与功能 | A80.2HCl浓度范围2-50 nM、ITC结合亲和力145 nM、CRBN敲除细胞系 阅读提示：Methods药代动力学部分、Fig. 5c和5f图注 |
| A80.2HCl联合CDK4/6i体内疗效 | A80.2HCl剂量6 mg/kg、palbociclib剂量100 mg/kg、给药方式口服灌胃、异种移植瘤每组5只NSG小鼠、mini-PDX每组6只小鼠 阅读提示：Methods异种移植瘤实验治疗部分、Fig. 6h和6i图注 |