构建PGRN减少的tau蛋白病小鼠模型并评估表型
探究PGRN减少对tau蛋白病小鼠体重、生存率和行为的影响。
将PS19与Grn−/−小鼠杂交生成6种基因型小鼠，监测体重和生存率，进行旷场实验、高架十字迷宫和Morris水迷宫测试。
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前颗粒蛋白减少通过葡萄糖脑苷脂酶增加tau和α-突触核蛋白包涵体并改变小鼠tau蛋白病表型
Reduced progranulin increases tau and α-synuclein inclusions and alters mouse tauopathy phenotypes via glucocerebrosidase.
实验完整度
高包含体外神经元培养、小鼠在体模型、snRNA-seq、脂质组学及人脑组织验证，并有功能与机制验证。
主要模型
PS19 tau蛋白病小鼠（人P301S tau转基因） Grn+/−和Grn−/−小鼠 原代小鼠海马和皮层神经元培养 人脑尸检组织（AD、DLB、FTD-GRN）
重点核对
6种基因型小鼠（WT、Grn+/−、Grn−/−、PS19、PS19 Grn+/−、PS19 Grn−/−）的体重、生存率和行为学检测 PS19背景下PGRN减少对AT8阳性tau包涵体类型和数量的影响 GCase活性测定及GlcCer/GlcSph免疫组化和脂质组学分析 原代神经元AD-tau播种实验中CBE或Grn−/−对tau聚集的影响 体外ThT assay中GlcCer或GCase对P301S tau聚集的影响
摘要
在许多神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病，AD）中可观察到共病性蛋白病，其随年龄增长而增加并影响临床结局，但其机制尚不明确。在此，我们展示前颗粒蛋白（PGRN）——一种与TDP-43蛋白病相关的溶酶体蛋白——的减少也会增加tau包涵体，导致α-突触核蛋白的伴随积累，并恶化tau蛋白病小鼠的死亡率和去抑制行为。包涵体的增加反而对空间记忆缺陷和海马神经退行性变具有保护作用。雄性tau蛋白病小鼠中PGRN的减少减弱了β-葡萄糖脑苷脂酶（GCase）的活性，GCase是一种先前与突触核蛋白病相关的蛋白，同时增加了葡萄糖神经酰胺（GlcCer）阳性的tau包涵体。在神经元培养中，GCase抑制增强了AD-tau诱导的tau聚集。此外，纯化的GlcCer在体外直接促进tau聚集。人类tau蛋白病中的神经原纤维缠结也具有GlcCer免疫反应性。因此，除TDP-43外，PGRN通过GCase和GlcCer调控tau蛋白病和突触核蛋白病。溶酶体PGRN–GCase通路可能是年龄相关共病性蛋白病的共同治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PGRN减少如何影响tau蛋白病中的tau和α-突触核蛋白病理，以及是否通过GCase和GlcCer发挥作用。
- 核心机制
- PGRN减少损害溶酶体GCase活性并改变其亚细胞定位，导致GlcCer积累；GlcCer直接促进tau聚集，GCase蛋白本身也可促进tau聚集，从而增加tau和α-突触核蛋白包涵体形成。
- 主要证据
- PS19小鼠中PGRN减少增加AT8和p-α-syn双阳性包涵体并降低GCase活性；原代神经元中GCase抑制或PGRN缺失增强AD-tau诱导的tau聚集；体外纯化GlcCer和GCase加速P301S tau聚集；人AD、DLB和FTD-GRN脑组织中NFTs呈GlcCer免疫反应性。
- 研究意义
- 揭示GlcCer在tau聚集中的意外作用，表明溶酶体PGRN–GCase通路可能是年龄相关共病性蛋白病的共同治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估PGRN减少对海马神经退行性变和转录组的影响
验证PGRN减少是否影响tau介导的脑萎缩、神经元丢失及海马转录组变化。
进行Nissl染色和体积分析、神经元层厚度测量，并对7月龄雄性小鼠海马进行snRNA-seq。
分析PGRN减少对tau病理模式的影响
探究PGRN减少是否改变tau包涵体的形成和分布。
用AT8抗体免疫组化分析海马、梨状/内嗅皮层和前额叶皮层的tau病理，并对CA2+CA3和杏仁核区域进行高倍共聚焦定量包涵体数量。
检测GCase活性和GlcCer积累
验证PGRN减少是否通过GCase和GlcCer影响tau包涵体形成。
测定皮层GCase活性，用抗GlcCer和GlcSph抗体进行免疫组化共定位，并进行SFC-MS/MS脂质组学分析GlcCer和GalCer种类。
在体外验证GlcCer和GCase对tau聚集的直接作用
确定GlcCer和GCase是否直接促进tau聚集。
在原代神经元中进行AD-tau播种实验，并给予CBE或vehicle处理；在体外进行ThT assay，将P301S tau与PC/GlcCer、PC/GlcSph、PC/GalCer脂质分散体或重组GCase共孵育，并用负染EM观察纤维形态。
在人类tau蛋白病脑组织中验证GlcCer和GCase与tau病理的共定位
检验小鼠和体外发现是否适用于人类tau蛋白病。
对AD、DLB和FTD-GRN脑组织切片进行AT8与GlcCer、GCase、p-α-syn共染色，定量NFTs中GlcCer阳性比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 原代神经元培养 | Neurobasal-A培养基 | GIBCO | 10888-022 |
| B27添加剂 | GIBCO | 17504-044 | |
| 细胞培养 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668-019 |
| 免疫组化 | 抗小鼠PGRN抗体 | R&D | AF2557 |
| AT8抗体 | Invitrogen | MN1020 | |
| 抗GlcCer抗体 | Glycobiotech | RAS_0011 | |
| 抗GCase抗体 | SIGMA | G4171 | |
| 抗磷酸化α-突触核蛋白抗体 | BioLegend | MMS-5091 | |
| 免疫印迹 | 抗tau抗体 | DAKO | A0024 |
| 抗FLAG M2亲和凝胶 | SIGMA | A2220 | |
| GCase活性测定 | 4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡萄糖苷 | SIGMA | M3633 |
| 溶酶体分离 | 溶酶体分离试剂盒 | SIGMA | LYSISO1 |
| snRNA-seq | Chromium单细胞3’GEM、文库和凝胶珠试剂盒v3 | 10X Genomics | PN-1000075 |
| ThT assay | 重组人P301S tau 2N4R | StressMarq | SPR-327 |
| 肝素 | SIGMA | H3393 | |
| 硫黄素T | SIGMA | T3516 | |
| 脂质分散体制备 | 脑磷脂酰胆碱 | Avanti Polar Lipids | 840053 P |
| 葡萄糖神经酰胺 | Avanti Polar Lipids | 860547 P | |
| AD-tau播种实验 | 小鼠tau抗体（T49） | SIGMA | MABN827 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠遗传背景与分组 | 6种基因型的杂交策略和遗传背景（PS19为B6C3F1，Grn−/−为C57BL/6J），行为学测试雌雄均用，生化分析仅用雄性 阅读提示：Methods中Animals小节 |
| CBE给药方案 | CBE剂量50 mg/kg/天，腹腔注射，连续21天；8月龄雄性WT小鼠 阅读提示：Methods中Conduritol B epoxide (CBE) treatment in mice小节 |
| AD-tau播种实验条件 | 原代神经元接种密度75,000细胞/孔，DIV7播种AD-tau并给予CBE（2、20、200 μM），DIV21固定检测；实验重复三次 阅读提示：Methods中AD-tau seeding assay小节 |
| ThT assay条件 | P301S tau浓度6.6 μM，肝素4.5 μM，ThT 25 μM，脂质分散体787 μM单体当量，GCase 1.2 μM；37°C监测255分钟 阅读提示：Methods中Thioflavin T assay小节 |
| snRNA-seq样本与重复 | 7月龄雄性小鼠，每种基因型3个生物学重复，共18个样本，185,974个细胞核；质控标准：去除线粒体计数>5%、表达基因<200或>2500的细胞核 阅读提示：Methods中Single-nucleus RNA sequencing和Quality control小节 |