BIRC6蛋白表达、纯化与结构解析
解析BIRC6三维结构并识别其结构域组织
在HEK293F细胞中过表达小鼠BIRC6，经FLAG亲和纯化和凝胶过滤，进行Cryo-EM数据采集和三维重建。
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BIRC6介导凋亡与自噬调控的分子机制
Molecular mechanisms underlying the BIRC6-mediated regulation of apoptosis and autophagy.
实验完整度
高包含Cryo-EM结构解析、体外结合与功能实验、细胞模型及突变体验证，具备功能与机制验证。
主要模型
HEK293F细胞表达的小鼠BIRC6蛋白 HEK293T、HeLa、MDA-MB-453、COS7、A549细胞系 Atg5+/+与Atg5−/−小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) LC3野生型与LC3缺陷型A549细胞
重点核对
BIRC6二聚体结构及Smac结合界面：Cryo-EM 3.6 Å和4.7 Å密度图 Smac竞争结合实验：50 μM Z-VAD-fmk存在下的免疫共沉淀 LC3结合LIR基序：100 μM LIR1肽及突变体处理 LC3 K51R突变对自噬和凋亡的影响：100 μg/mL CHX或20 μM etoposide处理 自噬诱导条件：雷帕霉素0.2–1.0 μM 24 h或HBSS饥饿0–6 h
摘要
Procaspase 9是凋亡的起始caspase，但其水平和活性如何维持尚不清楚。巨大的凋亡抑制蛋白BIRC6/BRUCE/Apollon分别通过促进促凋亡因子和关键自噬蛋白LC3的泛素化来抑制凋亡和自噬。在此，我们展示BIRC6形成一个反平行U形二聚体，具有多个先前未注释的结构域，包括一个泛素样结构域，并且促凋亡因子Smac/DIABLO结合于BIRC6的中心腔。值得注意的是，在细胞中Smac竞争性取代效应caspase 3和促凋亡蛋白酶HtrA2与BIRC6的结合，但不取代procaspase 9。BIRC6还通过其LC3相互作用区域与LC3结合，这可能发生在此BIRC6区域二聚体破坏之后。LC3泛素化位点的突变促进自噬和BIRC6的自噬性降解。此外，诱导自噬促进BIRC6和caspase 9的自噬性降解，但不促进其他效应caspase的降解。这些结果对于理解在病理生理条件下凋亡与自噬之间的平衡如何被调控具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BIRC6如何利用其泛素化功能调控凋亡与自噬的平衡？
- 核心机制
- BIRC6通过其LIR基序结合LC3，并介导LC3 K51泛素化抑制自噬；同时BIRC6结合procaspase 9并抑制caspase 9活性，而Smac竞争性释放caspase 3和HtrA2但不释放procaspase 9。
- 主要证据
- Cryo-EM结构揭示BIRC6二聚体及Smac结合模式；免疫共沉淀和体外结合实验显示Smac竞争结合；LC3 K51R突变促进自噬并抑制凋亡；自噬诱导促进BIRC6和caspase 9降解。
- 研究意义
- 这些结果有助于理解病理生理条件下凋亡与自噬平衡的调控机制，并可能为增强或抑制自噬和凋亡的治疗靶点发现提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Smac与BIRC6结合的结构与生化验证
确定Smac在BIRC6二聚体中心腔的结合模式
对BIRC6样品进行质谱鉴定内源Smac，并通过免疫共沉淀和凝胶过滤验证结合；对Smac结合的颗粒进行局部三维分类和精修。
Smac竞争结合及caspase抑制实验
验证Smac对BIRC6与caspase 3、HtrA2、procaspase 9结合的竞争性
在HEK293T细胞中共转染BIRC6与procaspase 9突变体及Smac野生型或突变体，进行免疫共沉淀；在细胞裂解液中用细胞色素c和dATP激活caspase，加入纯化BIRC6检测caspase活性。
自噬诱导下caspase 9和BIRC6的降解检测
检验自噬是否降解procaspase 9、active caspase 9和BIRC6
用雷帕霉素或HBSS饥饿处理多种细胞，免疫印迹检测蛋白水平；用Baf A1抑制自噬；在Atg5缺陷MEF中验证；免疫荧光观察caspase 9与LC3-II共定位。
BIRC6与LC3相互作用的LIR基序验证
确定BIRC6通过LIR基序与LC3结合及LIR1肽的浓度效应
合成LIR1肽、hu-LIR肽及其突变体，进行免疫共沉淀和体外结合实验；用AlphaFold2预测LIR1与BIRC6 N1区相互作用。
LC3 K51R突变对自噬和凋亡的功能影响
验证LC3 K51泛素化位点在平衡自噬和凋亡中的作用
在HEK293T、A549、HeLa细胞中转染GFP-LC3-WT或K51R，用CHX、雷帕霉素、Baf A1或etoposide处理，免疫印迹检测LC3-II/I、p62、BIRC6和cleaved caspase 3；免疫荧光检测LC3斑点；TUNEL检测凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白质相互作用与功能验证
蛋白质表达与检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| BIRC6蛋白纯化 | M2-FLAG亲和珠 | Millipore | M8823 |
| 3×FLAG肽 | -- | -- | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL色谱柱 | Cytiva | -- | |
| His标签蛋白纯化 | Ni-NTA珠 | -- | -- |
| Superdex TM 75 10/300 GL色谱柱 | Cytiva | -- | |
| His标签蛋白诱导表达 | 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | Beyotime | ST098-5g |
| 质谱分析 | EASY-nLC 1200液相色谱柱 | -- | -- |
| Thermo Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo | -- | |
| 冷冻电镜数据采集 | FEI Titan Krios显微镜 | FEI | -- |
| Gatan GIF K3相机 | Gatan | -- | |
| 负染电镜 | JEOL JEM-1400Flash显微镜 | JEOL | -- |
| 细胞培养 | SMM 293-TII HEK293细胞完全培养基（无动物源、无血清） | Sino Biological Inc. | -- |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 自噬诱导处理 | 雷帕霉素 | Sigma-Aldrich | V900930 |
| 自噬抑制处理 | 巴弗洛霉素A1 | Enzo life sciences | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies, Inc. | -- |
| 免疫荧光 | 抗procaspase 9小鼠IgG | Santa Cruz | SC56076 |
| 抗LC3兔IgG | MBL | PM036 | |
| 抗兔Alex-594二抗 | ZSGB-BIO | ZF-0513 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Sigma-Aldrich | 28718-90-3 | |
| 免疫印迹 | 抗BIRC6抗体 | BD Biosciences | 611193 |
| 抗XIAP抗体 | BD Biosciences | 610717 | |
| 抗Smac抗体 | Zymed | 35-6600 | |
| 抗HtrA2抗体 | oncogene | Am82 | |
| 抗ATG5抗体 | Cell Signaling Technology | 12994 | |
| 抗Myc抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| 抗GFP抗体 | Absin | 137960 | |
| 抗Apaf-1抗体 | Cell Signaling Technology | 8969 | |
| 抗PA28γ抗体 | Enzo | PW8190 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | 25778 | |
| 抗p62抗体 | Cell Signaling Technology | 88588 S | |
| 抗UBA6抗体 | Cell Signaling Technology | 13386 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| 抗Caspase 9抗体 | Cell Signaling Technology | 9508 | |
| 抗Caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| 抗Cleaved Caspase 3抗体 | abcam | ab32042 | |
| 抗Caspase 7抗体 | Sigma-Aldrich | SAB4503316 | |
| 抗LC3抗体 | Sigma-Aldrich | L7543 | |
| 抗β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| 过氧化物酶标记抗小鼠IgG | ZSGB-BIO | ZB-5305 | |
| 过氧化物酶标记抗大鼠IgG | ZSGB-BIO | ZB-2307 | |
| 过氧化物酶标记抗兔IgG | ZSGB-BIO | ZB-5301 | |
| ECL检测系统 | EMD Millipore | -- | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G-琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | -- |
| Caspase活性测定 | caspase 9底物Ac-LEHD-AMC | Enzo | ALX-260-080-M001 |
| caspase 3底物Z-DEVD-7-AMC | Merck | 235425 | |
| 细胞裂解 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 4693132001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BIRC6纯化与Cryo-EM | HEK293F细胞瞬转48小时，FLAG亲和纯化后凝胶过滤，交联条件0.01%戊二醛10分钟；Cryo-EM全局分辨率3.6 Å 阅读提示：Methods: Purification of BIRC6; Cryo-EM data collection |
| Smac竞争结合实验 | HEK293T细胞共转染，50 μM Z-VAD-fmk，免疫共沉淀使用抗Myc或抗BIRC6抗体；Smac IBM突变AVPI→AAAI 阅读提示：Figure 3 legend; Methods: Immunoprecipitation |
| 自噬诱导降解实验 | 雷帕霉素0.2、0.5、1.0 μM处理24小时；HBSS饥饿0、1、2、4、6小时；Baf A1 10 nM 阅读提示：Figure 4 legend; Methods: Cell culture |
| LC3 K51R功能实验 | CHX 100 μg/mL；雷帕霉素0.5 μM 24小时；Baf A1 0.1 μM 2小时；etoposide 20 μM 12小时或24小时；TUNEL n=20图像，LC3斑点n=30图像 阅读提示：Figure 6 legend |
| LIR肽结合实验 | LIR1肽、hu-LIR肽及其突变体浓度100 μM（部分实验0–400 μM）；体外结合FLAG-BIRC6 0.1 μM与His-LC3 0.5 mg，孵育30分钟室温 阅读提示：Figure 5 legend; Methods: In vitro BIRC6 binding assays |