单细胞转录组图谱构建与分化轨迹推断
描绘人角膜缘-角膜上皮发育和分化的分子动态与细胞状态转变轨迹
整合已发表scRNA-seq数据集（133,490个高质量单细胞），无监督聚类注释细胞亚群，使用PHATE、latent time、RNA velocity、Dynamo等推断分化轨迹和基因加速动力学
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驱动角膜上皮分化的单细胞转录组图谱及RORA介导的三维表观基因组重塑
The single-cell transcriptomic atlas and RORA-mediated 3D epigenomic remodeling in driving corneal epithelial differentiation.
实验完整度
高含单细胞转录组图谱、原代LSC体外分化模型、过表达/敲低功能验证、ChIP-seq及启动子捕获Hi-C机制验证
主要模型
原代人类角膜缘干/祖细胞（LSC） 体外诱导分化的成熟角膜上皮细胞（CEC） 人角膜缘-角膜组织样本
重点核对
RORA和PITX1在原代LSC中过表达后EdU阳性细胞百分比（n=6独立实验） RORA或PITX1过表达后CEC标志物（KRT3、KRT12、KRT24、CLU等）及LSC标志物（KRT15、BCAM、IFITM3等）的表达变化 SR3335（RORA反向激动剂）处理或PITX1敲低后CEC分化标志物的丢失 RORA过表达LSC中H3K27ac、H3K4me3和H3K27me3修饰的差异峰数量（H3K27ac增加7468/减少4949；H3K27me3增加1804/减少1426） RORA过表达LSC中启动子锚定染色质相互作用（启动子-启动子和启动子-非启动子区域环）的变化
摘要
角膜上皮细胞（CEC）从角膜缘干/祖细胞（LSC）的正常分化是维持眼部稳态和清晰视力所必需的。在此，我们利用单细胞转录组图谱，描绘了人类CEC发育和分化过程中全面且精细的分子调控动态。我们发现RORA是一个CEC特异性分子开关，通过激活PITX1来启动并驱动LSC分化为成熟CEC。RORA通过建立CEC特异性增强子以及CEC基因启动子与远端调控元件之间的染色质相互作用来决定CEC分化。相反，RORA沉默LSC特异性启动子并破坏启动子锚定的染色质环以关闭LSC基因。总之，我们的工作为人类角膜上皮分化背后的转录动态和RORA介导的表观遗传重塑提供了详细而全面的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类角膜上皮从LSC向CEC分化的分子调控动态及特异性分子开关是什么？
- 核心机制
- RORA作为CEC特异性分子开关，通过激活PITX1启动CEC分化程序；RORA通过建立CEC特异性增强子和启动子锚定的染色质相互作用激活CEC基因，同时沉默LSC启动子并破坏启动子锚定的染色质环以关闭LSC基因。
- 主要证据
- 单细胞转录组图谱（scRNA-seq）推断分化轨迹和TF调控网络；原代LSC体外分化模型结合RORA/PITX1过表达和功能缺失实验验证分化表型；ChIP-seq和启动子捕获Hi-C揭示RORA介导的表观遗传和三维染色质重塑。
- 研究意义
- 提供了人类角膜上皮分化过程中转录动态和RORA介导的表观遗传重塑的详细见解，有助于理解角膜稳态和发病机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
核心转录因子筛选与鉴定
鉴定能诱导LSC向CEC转变的核心转录因子
CellRank分析鉴定与终末命运概率相关的TF，与原代LSC体外分化模型的bulk RNA-seq差异基因取交集，筛选出RORA、PITX1、DBP、NR1D1候选因子；进一步通过SCENIC、kNN-DREMI和免疫荧光验证RORA和PITX1的表达特异性
计算机模拟扰动预测RORA/PITX1功能
预测RORA和PITX1在体内角膜上皮分化中的功能
使用CellOracle和Dynamo进行RORA或PITX1的单基因及双基因虚拟敲除和激活模拟，预测细胞状态偏移方向；RNA Jacobian分析推断RORA/PITX1对下游基因的调控关系
RORA/PITX1功能获得与缺失验证
实验验证RORA和PITX1对LSC增殖和CEC分化的调控作用
在原代LSC中过表达RORA或PITX1，检测EdU增殖和分化/干性标志物表达；使用SR3335抑制RORA或敲低PITX1，检测分化标志物；PITX1过表达挽救SR3335造成的分化障碍
RORA介导的表观遗传和三维染色质重塑分析
解析RORA如何通过表观遗传修饰和染色质三维相互作用调控CEC分化
在对照和RORA过表达LSC中进行ChIP-seq（H3K27ac、H3K4me3、H3K27me3、FLAG）和启动子捕获Hi-C，分析组蛋白修饰变化和启动子锚定的染色质环变化
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | IV型胶原酶 | Gibco | 17104019 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 基质胶 | BD Biosciences | 354230 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-044 | |
| 表皮生长因子 | millipore | GF144 | |
| 胰岛素 | sigma | I5500 | |
| 氢化可的松 | Millipore | 386698 | |
| 霍乱毒素 | sigma | C8052 | |
| 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸 | sigma | T2877 | |
| 角质形成细胞无血清培养基 | Gibco | 10744-019 | |
| 病毒包装 | Lipofectamine 3000试剂盒 | Invitrogen | L3000015 |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Invitrogen | A11138-03 |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| 逆转录 | PrimeScrip逆转录预混液试剂盒 | Takara | RR036A |
| qRT-PCR | iTaq Universal SYBR Green预混液试剂盒 | Bio–Rad | 1725125 |
| 免疫荧光 | 抗KRT3抗体 | Abcam | ab68260 |
| 抗KRT12抗体 | Abcam | ab124975 | |
| 抗LGALS3抗体 | Biolegend | 125401 | |
| 抗S100A2抗体 | Abcam | ab109494 | |
| 抗KRT15抗体 | NeoMarkers | MS-1068-P0 | |
| 抗IFITM3抗体 | Proteintech | 11714-1-AP | |
| 抗PAX6抗体 | Sigma | AMAB91372 | |
| 抗ALDH3A1抗体 | GeneTex | GTX30042 | |
| 抗CLU抗体 | Proteintech | 12289-1-AP | |
| 抗KRT19抗体 | Biolegend | 628502 | |
| 抗RORA抗体 | Immunoway | YT4166 | |
| 抗PITX1抗体 | Sigma | HPA008743 | |
| 抗KRT14抗体 | Thermo | MA511599 | |
| 抗KI67抗体 | Cell Signaling Technology | 9129 S | |
| 抗TP63抗体 | Cell Signaling Technology | 67825 S | |
| 抗兔IgG（Alexa Fluor 488偶联） | CST | 4412 S | |
| 抗鼠IgG（Alexa Fluor 488偶联） | CST | 4408 S | |
| 抗兔IgG（Alexa Fluor 594偶联） | CST | 8889 S | |
| 抗鼠IgG（Alexa Fluor 594偶联） | CST | 8890 S | |
| EdU检测 | BeyoClick EdU细胞增殖试剂盒（Alexa Fluor 555） | Beyotime | C0075S |
| ChIP-seq | 甲醛 | Invitrogen | 28906 |
| RNase A | Invitrogen | EN0531 | |
| 蛋白酶K | Invitrogen | AM2546 | |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| VAHTS Universal DNA文库构建试剂盒（Illumina V3） | Vazyme | -- | |
| 抗H3K27ac抗体 | Millipore | 07-360 | |
| 抗H3K27me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9733 | |
| 抗H3K4me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9751 | |
| 抗FLAG抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 启动子捕获Hi-C | HindIII限制性内切酶 | NEB | R3104S |
| 生物素-14-dCTP | Invitrogen | 19518018 | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202S | |
| QIAamp DNA Mini试剂盒 | Qiagen | -- | |
| SureSelect XT文库构建试剂盒ILM | Agilent Technologies | G9981A | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | a63880 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原代LSC分离与培养 | 组织消化条件（0.2% IV型胶原酶37°C 2h，0.25%胰蛋白酶-EDTA 15min）、培养基成分（DMEM/F12+DMEM 1:1、10% FBS、10 ng/ml EGF、5 μg/ml胰岛素、0.4 μg/ml氢化可的松、0.1 nM霍乱毒素、2 nM T3）、Matrigel包被 阅读提示：Methods中Human primary LSC culture and in vitro differentiation小节 |
| 体外诱导分化 | LSC汇合后切换至K-SFM培养基含1.2 μM钙，分化时间一周 阅读提示：Methods中Human primary LSC culture and in vitro differentiation小节 |
| RORA/PITX1过表达与敲低 | 慢病毒感染24h，2 μg/mL嘌呤霉素筛选48h；PITX1 shRNA序列及scrambled对照序列；flag-tagged RORA和PITX1克隆至pCDH，空载体对照 阅读提示：Methods中Gene knockdown and overexpression小节 |
| EdU增殖检测 | EdU试剂处理2h，BeyoClick EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 555，n=6独立实验 阅读提示：Methods中EdU assay小节及Fig. 3d图注 |
| ChIP-seq | 1%甲醛固定10min，0.125M甘氨酸淬灭5min，染色质超声至200-400bp，抗体5μg/ChIP；H3K27ac和H3K4me3使用–extsize 200，H3K27me3使用–extsize 500 –broad 阅读提示：Methods中ChIP-Seq和ChIP-seq data analysis小节 |
| 启动子捕获Hi-C | 1%甲醛交联10min，0.2M甘氨酸淬灭5min，0.3% SDS灭活内源核酸酶，100 U HindIII酶切，biotin-14-dCTP标记，50 U T4 DNA连接酶连接；CHiCAGO score≥5，差异相互作用|log fold change|>1且p<0.05 阅读提示：Methods中Promoter capture Hi-C和Promoter capture Hi-C data analysis小节 |