构建并纯化CT-SLiM修饰的Drp1变体
获得可区分CT-SLiM不同功能贡献的Drp1变体，用于后续结构与功能分析。
构建ΔCT4、ΔCT6缺失变体及CT+、CT+*、CT+sh延伸变体，分别在大肠杆菌中表达，经His6亲和与离子交换层析纯化；用于iTFS的位点突变体通过定点诱变构建。
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通过无序C端短线性基序对动力相关蛋白1的变构调控
Allosteric control of dynamin-related protein 1 through a disordered C-terminal Short Linear Motif.
实验完整度
高结合NS-EM、冷冻电镜、SAXS、Trp荧光、GTP酶测定、体外膜管裂变重建及Drp1 KO MEFs体内验证
主要模型
人源及鼠源Drp1重组蛋白（WT及CT变体） CL脂质体与GalCer脂质纳米管 游离脂质纳米管（NT）裂变体系 Drp1 KO小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）
重点核对
CT变体设计：ΔCT4、ΔCT6缺失及CT+、CT+*、CT+sh非天然延伸，N端His6标签 NS-EM在apo、GMP-PCP结合和GTP水解状态下对Drp1二聚体和环状寡聚体进行2D分类 GTP酶活性测定：Drp1 0.5 μM，CL脂质体150 μM总脂，kcat及burst动力学 NT裂变实验：Drp1 0.5 μM，1 mM GTP，实时荧光监测裂变与收缩半径 Drp1 KO MEFs过表达Myc标记WT及CT变体，统计线粒体碎片化和过氧化物酶体圆形度
摘要
动力相关蛋白1（Drp1）是一种机械化学GTP酶，催化线粒体和过氧化物酶体裂变，但其调控机制仍不明确。本研究发现，位于Drp1 C端最末端的一个保守、内在无序的六残基短线性基序（命名为CT-SLiM）构成了关键的变构位点，在体外和体内控制Drp1的结构和功能。用非天然残基延伸CT-SLiM，或使其与蛋白伴侣GIPC-1相互作用，会限制Drp1亚基的构象动力学，改变其自组装特性，并限制协同GTP水解，令人意外的是这会导致体外模型膜的裂变。在体内，天然CT-SLiM的参与对有效的线粒体和过氧化物酶体裂变至关重要，因为CT-SLiM的缺失和非天然延伸均严重损害其进程。因此，与主流模型相反，Drp1催化的膜裂变依赖于由CT-SLiM介导的变构通讯、GTP酶活性的减速以及亚基结构和组装-解组装动力学的耦合变化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Drp1 C端保守无序六残基短线性基序（CT-SLiM）如何调控Drp1的结构、组装、GTP酶活性及线粒体/过氧化物酶体裂变功能。
- 核心机制
- 天然CT-SLiM作为变构开关限制Drp1二聚体构象动力学、维持有序螺旋组装并限制GTP水解速率；其与GIPC-1相互作用可缓解自抑制并促使Drp1向组装致敏的紧凑构象转变，从而协调膜收缩与裂变。
- 主要证据
- NS-EM和3D重建显示CT变体构象分布改变；SEC-MALS和SEC-SAXS显示寡聚化和柔性差异；Trp荧光显示W699微环境变化；GTP酶测定显示ΔCT变体活性升高、CT+降低；NT裂变实验显示CT+和GIPC-1存在下WT促进裂变而WT单独仅收缩；Drp1 KO MEFs中ΔCT和CT+均损害线粒体与过氧化物酶体裂变。
- 研究意义
- 研究提出CT-SLiM是Drp1催化膜裂变的关键变构调控元件，挑战了以GTP水解加速为主导的主流模型，并提示C端极端区域可能是动力蛋白超家族蛋白保守的调控特征。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估CT-SLiM修饰对Drp1寡聚化和螺旋组装的影响
验证CT-SLiM是否决定Drp1的自组装倾向和螺旋几何。
在GMP-PCP存在下用NS-EM观察Drp1环状和螺旋寡聚体形态，统计环直径和螺旋长度；在无核苷酸apo状态下用SEC-MALS分析寡聚化状态。
解析CT-SLiM对Drp1构象动力学的影响
确定CT-SLiM是否限制Drp1二聚体在延伸与紧凑构象间的转换，以及CT+变体的构象基础。
用NS-EM 2D分类分析apo、GMP-PCP和GTP状态下Drp1二聚体和环状寡聚体构象；用cryoSPARC进行3D重建并对接ΔVD Drp1二聚体晶体结构；用SEC-SAXS分析R403A最小二聚体；用AlphaFold预测CT+延伸结构；用iTFS检测W699微环境。
测定CT-SLiM修饰对GTP水解的影响
验证CT-SLiM是否调控Drp1的协同GTP水解和膜上组装-解组装动力学。
用孔雀石绿比色法测定基础和CL刺激的GTP酶活性，分析burst和稳态动力学；用共沉降实验检测Drp1与GalCer CL-NT的结合；用NS-EM观察GTP存在下Drp1在脂质模板上的组装和解组装。
体外重建CT-SLiM对膜管裂变的调控
检验CT-SLiM修饰及GIPC-1相互作用对Drp1催化膜裂变能力的影响。
在微流控室中形成悬浮脂质纳米管，加入Drp1变体或Drp1-GIPC-1混合物，实时荧光显微监测纳米管收缩和裂变；用冷冻电镜分析Drp1在预形成纳米管上的组装形态。
体内验证CT-SLiM对线粒体和过氧化物酶体裂变的必要性
确定CT-SLiM修饰是否影响Drp1在细胞内催化线粒体和过氧化物酶体裂变的功能。
在Drp1 KO MEFs中转染Myc标记的WT、ΔCT4、ΔCT6和CT+变体，免疫荧光检测Tom20标记的线粒体和PEX14标记的过氧化物酶体形态，并统计线粒体碎片化比例、网络连接性和过氧化物酶体圆形度；用 Western blot 和 co-IP 检测蛋白表达及与内源GIPC-1的相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证GTP酶活性与膜结合
验证细胞与体内功能
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | pRSET C载体 | Invitrogen | -- |
| pET21b载体 | Novagen | -- | |
| pET Biotin His6 FLASH载体 | Addgene | 30184 | |
| pCMV-Myc载体 | Clontech | -- | |
| pCMV6载体 | Origene | -- | |
| pGEX-6P1载体 | Cytiva | -- | |
| Bio-Rad SEC650柱 | Bio-Rad | -- | |
| SEC-MALS | Superose 6 10/300GL色谱柱 | Cytiva | -- |
| ÄKTApure快速蛋白液相色谱系统 | Cytiva | -- | |
| DAWN Heleos-II 18角度多角度光散射仪 | Wyatt Technology | -- | |
| Optilab T-rEX示差折光检测器 | Wyatt Technology | -- | |
| Superdex 200 10/300 GL色谱柱 | -- | -- | |
| 负染电镜 | 醋酸铀 | Polysciences, Inc. | -- |
| Tecnai T12电子显微镜 | FEI Co. | -- | |
| Gatan 4k × 4k相机 | Gatan | -- | |
| TF-20场发射电子显微镜 | FEI Co. | -- | |
| Tvips Tietz 4k × 4k CMOS相机 | Tvips Tietz | -- | |
| 脂质体制备 | 牛心心磷脂 | Avanti Polar Lipids Inc. | -- |
| 二油酰磷脂酰胆碱 | Avanti Polar Lipids Inc. | -- | |
| C24:1 β-D-半乳糖神经酰胺 | Avanti Polar Lipids Inc. | -- | |
| SEC-SAXS | Superdex 200 10/300GL increase色谱柱 | -- | -- |
| iTFS | 4 × 4 mm石英比色皿 | Starna Cells, Inc. | -- |
| Fluorolog 3-22光子计数荧光光谱仪 | Horiba Jobin Yvon | -- | |
| 共沉降实验 | InstantBlue考马斯蛋白染色液 | abcam | -- |
| NT裂变实验 | Nikon Eclipse Ti倒置荧光显微镜 | Nikon | -- |
| CoolLed pE-4000光源 | CoolLed | -- | |
| Zyla 4.2 sCMOS相机 | Andor | -- | |
| 冷冻电镜 | Quantifoil R 2/2 300目铜网 | Quantifoil | -- |
| Vitrobot冷冻制样系统 | Thermofisher | -- | |
| JEOL JEM-2200FS/CR显微镜 | JEOL | -- | |
| Gatan K2 Summit直接电子探测相机 | Gatan Inc. | -- | |
| 细胞培养与转染 | 明胶 | Sigma | G1393 |
| 细胞转染 | TransIT-2020转染试剂 | Mirus | MIR 5404 |
| 免疫荧光 | 正常山羊血清 | Thermofisher Scientific | 31872 |
| Alexa-488标记的山羊抗兔抗体 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| Alexa-568标记的山羊抗小鼠抗体 | ThermoFisher Scientific | A11031 | |
| 抗Myc抗体 | Santa Cruz | sc-40 | |
| 抗Tom20抗体 | Proteintech | 11802-1-AP | |
| 抗PEX14抗体 | Proteintech | 10594-1-AP | |
| Olympus Fluoview 1000共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| Olympus Fluoview 3000共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| Western blot | 抗Flag抗体 | MilliporeSigma | F1804 |
| 抗肌动蛋白抗体 | MilliporeSigma | A1978 | |
| 抗Drp1抗体 | BD Bioscience | 611113 | |
| 抗GIPC-1抗体 | Santa Cruz | sc-271822 | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G磁珠 | Santa Cruz | sc-2003 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Drp1 CT变体设计与纯化 | 各变体的具体缺失或延伸序列、N端His6标签位置、CT+延伸长度（24 aa）及CT+sh裂解方式 阅读提示：Methods 的 Protein production 小节及 Supplementary Fig. 1c |
| NS-EM寡聚体与构象分析 | Drp1浓度2 μM、GMP-PCP 1 mM、MgCl2 2 mM、孵育30分钟、电镜放大倍数及颗粒数 阅读提示：Methods 的 NS-EM and data processing 小节及 Fig. 1b、Fig. 2a 图注 |
| SEC-MALS寡聚化分析 | 注射浓度5 μM、Superose 6 10/300 GL柱、峰值检测浓度约0.5 μM 阅读提示：Methods 的 SEC-MALS 小节及 Fig. 1e 图注 |
| GTP酶活性测定 | Drp1 0.5 μM、CL脂质体150 μM总脂、GTP浓度、温度37 °C、重复数n=2（WT基础和CL刺激分别为n=3和n=5） 阅读提示：Methods 的 GTPase assay 小节及 Fig. 3 图注 |
| NT裂变实验 | Drp1 0.5 μM、GTP 1 mM、GIPC-1与Drp1 1:1摩尔比、膜组成PC:PE:CL:RhPE 55:29.5:15:0.5 mol%、独立实验n=3 阅读提示：Methods 的 NT fission assay 小节及 Fig. 4b、Fig. 5f 图注 |
| Drp1 KO MEFs体内裂变验证 | 各变体转染后24小时固定、抗体稀释比、分析细胞数（WT n=91、ΔCT4 n=17、ΔCT6 n=31、CT+ n=92） 阅读提示：Methods 的 Cell biology 与 Quantification of mitochondrial connectivity and peroxisomal circularity 小节及 Fig. 6 图注 |