设计并合成双功能降解剂
构建可同时结合LC3B与靶蛋白配体的双功能分子以探索自噬性降解。
将芳亚甲基吲哚酮与PDEδ配体、JQ1或ibrutinib衍生物通过不同连接子连接，合成化合物5、6、7、9、10、11、13等。
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发现一种类药性、天然产物启发的DCAF11配体化学型
Discovery of a Drug-like, Natural Product-Inspired DCAF11 Ligand Chemotype.
实验完整度
高包含细胞系降解实验、CRISPR/Cas9筛选、敲除/回补、共价结合与体外结合验证
主要模型
Jurkat细胞 Hep G2细胞 KBM7细胞（含BRD4-BFP报告细胞） HAP1细胞
重点核对
化合物5处理Jurkat细胞6 h的剂量依赖性和10 μM下的时间依赖性PDEδ降解 化合物9处理Jurkat细胞6 h、3 μM下BRD2/3/4降解及DC50 255 nM、Dmax 84% FACS-based CRISPR/Cas9筛选鉴定DCAF11为关键CRL底物受体 DCAF11敲除（KO1、KO2）或siRNA敲低abolishes化合物9、10、11诱导的BRD2降解 BODIPY标记探针18与纯化DCAF11结合，可被未标记化合物2竞争
摘要
靶向蛋白酶体和自噬性蛋白降解（常采用双功能分子）是调控蛋白功能的新范式。为探索通过自噬实现蛋白降解，我们将据报可结合自噬相关LC3B蛋白的芳亚甲基吲哚酮与PDEδ脂蛋白伴侣、含溴结构域的BRD2/3/4蛋白以及BTK和BLK激酶的配体组合。出乎意料的是，所得双功能降解剂并不通过巨自噬诱导蛋白降解，而是将其靶标导向泛素-蛋白酶体系统。靶标与机制鉴定揭示，芳亚甲基吲哚酮共价结合DCAF11，即CUL4A/B-RBX1-DDB1-DCAF11 E3连接酶的底物受体。这些经过调和的α,β-不饱和吲哚酮亲电体定义了一类类药性DCAF11配体，使得能够在化学生物学和药物化学项目中探索该E3连接酶。芳亚甲基吲哚酮骨架常见于天然产物中，这引出了是否能在天然产物及相关化合物中更广泛地发现E3配体类别的问题。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过结合LC3B的双功能分子经巨自噬实现PDEδ等靶蛋白的有效降解。
- 核心机制
- 含α,β-不饱和芳亚甲基吲哚酮的双功能降解剂共价结合DCAF11底物受体，招募CUL4A/B-RBX1-DDB1-DCAF11 E3连接酶，经泛素-蛋白酶体系统而非巨自噬降解靶蛋白。
- 主要证据
- Jurkat、HEK293T、HAP1等细胞中化合物5、6、7诱导PDEδ降解，化合物9、10、11诱导BRD2/3/4降解；自噬抑制剂和LC3B/FIP200敲除不影响降解，蛋白酶体抑制剂和neddylation抑制剂阻断降解；CRISPR筛选、DCAF11敲除/敲低及回补、共免疫沉淀、生物素和BODIPY探针结合实验支持DCAF11介导机制。
- 研究意义
- 定义了一类类药性、天然产物启发的DCAF11配体化学型，可能促进该E3连接酶在化学生物学和药物化学项目中的更广泛探索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估靶蛋白降解活性
验证双功能化合物是否诱导PDEδ、BET蛋白及BTK/BLK降解。
在Jurkat、HEK293T、HAP1、Hep G2、MDA-MB-231、Ramos等细胞中处理化合物，用免疫印迹检测靶蛋白水平。
确定降解途径
判断降解是否依赖巨自噬或蛋白酶体。
用自噬抑制剂CQ、NH4Cl、Baf A1，蛋白酶体抑制剂CFZ、MG-132，neddylation抑制剂MLN4924预处理，并在LC3B或FIP200敲除细胞中检测降解。
鉴定E3连接酶
确定介导降解的E3连接酶复合体。
在KBM7 BRD4-BFP报告细胞中进行FACS-based CRISPR/Cas9筛选，并用siRNA、敲除和回补验证DCAF11、DDB1、RBX1的作用。
验证共价结合与构效关系
确认芳亚甲基吲哚酮与DCAF11的直接共价结合并探索配体结构优化。
用饱和类似物、氯乙酰胺15、生物素探针14、BODIPY探针18、In-Cell Western及一系列吲哚酮类似物进行结合与活性评价。
评估细胞毒性与凋亡
考察BET靶向降解剂的抗增殖和凋亡诱导作用。
用CellTiter-Glo和Caspase-Glo 3/7检测Jurkat和Hep G2细胞活力及caspase-3/7活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 氯喹 | Sigma | C6628 |
| 氯化铵 | J.T.Baker | 0018 | |
| 巴弗洛霉素A1 | Cell Signaling Technology (CST) | 54645S | |
| 卡非佐米 | Abcam | ab216469 | |
| MG-132 | CST | 2194S | |
| MLN4924 | CST | 85923S | |
| JQ1 | Sigma-Aldrich | SML1524 | |
| Western blot | 抗BRD2抗体 | Cell Signaling Technology | 5848S |
| 抗BRD4抗体 | Cell Signaling Technology | 13440S | |
| 抗LC3B抗体 | Cell Signaling Technology | 2775S | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118S | |
| 抗DDB1抗体 | Cell Signaling Technology | 6998S | |
| 抗BTK抗体 | Cell Signaling Technology | 8547S | |
| 抗BLK抗体 | Cell Signaling Technology | 3262S | |
| 抗FIP200抗体 | Cell Signaling Technology | 12436S | |
| 抗V5标签抗体 | Cell Signaling Technology | 13202S | |
| 抗FLAG标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2368S | |
| In-Cell Western | 抗BRD2抗体 | Abcam | ab139690 |
| Western blot | 抗BRD3抗体 | Abcam | ab50818 |
| 抗RBX1抗体 | Abcam | ab133565 | |
| 抗PDEδ抗体 | Invitrogen | PA5-22008 | |
| 抗Vinculin抗体 | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| 抗DCAF11抗体 | ABclonal | A15519 | |
| HRP标记链霉亲和素 | Thermo Fisher | N100 | |
| HRP抗兔二抗 | Invitrogen | 31460 | |
| HRP抗鼠二抗 | Invitrogen | 62-6520 | |
| 流式细胞术 | APC抗CD90.1/Thy1.1抗体 | BioLegend | 202526 |
| 人Fc受体封闭液 | BioLegend | 422302 | |
| Western blot | 完全蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836170001 |
| DC蛋白定量试剂 | BIO-RAD | 5000116 | |
| PVDF膜 | Thermo scientific | 88518 | |
| Intercept封闭缓冲液 | LI-COR Biosciences | 927-70001 | |
| Western blot检测试剂 | Thermo Scientific | 34095 | |
| RT-qPCR | RNeasy Plus迷你试剂盒 | QIAGEN | 74134 |
| 无RNase DNase套装 | QIAGEN | 79256 | |
| QuantiTect逆转录试剂盒 | QIAGEN | 205313 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒 | Qiagen | 330502 | |
| RNA干扰 | 非靶向siRNA | Horizon Discovery Ltd | D-001810-10-05 |
| DCAF11 siRNA | Horizon Discovery Ltd | L-019051-01-0005 | |
| RBX1 siRNA | Horizon Discovery Ltd | L-004087-00-0005 | |
| DharmaFECT 1转染试剂 | Horizon Discovery Ltd | T-2001-02 | |
| CRISPR筛选 | 聚乙烯亚胺（PEI MAX MW 40,000） | Polysciences | -- |
| G418 | Gibco | -- | |
| 多西环素 | PanReac AppliChem | -- | |
| Zombie NIR可固定活力染料 | BioLegend | -- | |
| dBET6 | MedChem Express | -- | |
| AmpliTaq Gold | Invitrogen | -- | |
| Mag-Bind TotalPure NGS磁珠 | Omega Bio-tek | -- | |
| 共免疫沉淀 | FuGENE HD转染试剂 | Promega | E2311 |
| 抗FLAG磁珠 | Sigma | M8823 | |
| HA-DCAF11质粒 | Sino Biological | HG16257-NY | |
| 亲和富集 | Pierce链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher | 88817 |
| pCMV3-N-HA-DCAF11质粒 | Sino Biological | HG16257-NY | |
| pcDNA3.1(+)空载体 | Thermo Fisher | V79020 | |
| 凝胶内荧光 | 纯化DCAF11蛋白 | Origene | TP760719 |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo试剂 | Promega | G7571 |
| 凋亡检测 | Caspase-Glo 3/7试剂 | Promega | G8091 |
| 热位移实验 | Hard-Shell 384孔480 PCR板 | BioRAD | HSR4805 |
| Lightcycler 480封板膜 | Roche | 04 729 757 001 | |
| SIRT活性检测 | SIRT荧光检测试剂盒 | BPS Bioscience | 50081, 50087, 50088, 50085, 50022 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PDEδ降解与途径验证 | 化合物5浓度10 μM、处理6 h；自噬抑制剂CQ 50 μM、NH4Cl 15 mM、Baf A1 0.3 μM预处理2 h；蛋白酶体抑制剂CFZ 0.2 μM或1 μM、MG-132 10 μM、MLN4924 1 μM预处理2 h；LC3B敲除HAP1细胞 阅读提示：Fig. 1b–h图注及Results“PDEδ is degraded through the UPS, not through macroautophagy” |
| BET蛋白降解与途径验证 | 化合物9 3 μM处理6 h；CQ 50 μM、CFZ 1 μM、MLN4924 1 μM预处理40 min；BRD2 DC50 255 nM、Dmax 84%；FIP200敲除KBM7细胞 阅读提示：Fig. 2b–d图注及Results“BET proteins and kinases are degraded through the UPS” |
| BTK/BLK降解验证 | 化合物13处理Ramos细胞6 h；CQ 50 μM、CFZ 1 μM、MLN4924 1 μM预处理40 min；BLK和BTK分别降低70%和50% 阅读提示：Fig. 2f–h图注及对应Results段落 |
| CRISPR/Cas9筛选 | BRD4-BFP报告KBM7 iCas9细胞；sgRNA文库每基因8条；DOX 0.4 μg/mL诱导72 h；化合物9 0.5 μM、10 1 μM、dBET6 10 nM处理6 h；两个生物学重复 阅读提示：Methods“CRISPR–Cas9 knockout screens”及Fig. 3a–c图注 |
| DCAF11靶标验证 | DCAF11 siRNA 50 nM处理Hep G2 72 h；DCAF11 KO1/KO2 KBM7细胞；DDB1敲除DOX 0.5 μg/mL 3天；RBX1 siRNA 30 nM处理MDA-MB-231 48 h 阅读提示：Fig. 3d–i图注及Methods“RNA interference”“CRISPR-mediated DCAF11 and FIP200 knockout” |
| 共价结合验证 | 化合物9 10 μM处理Hep G2 4–5 h；氯乙酰胺15 30 μM预处理1 h；探针14 10 μM孵育2 h；探针18 100 μM荧光偏振；DCAF11 C443A/C460A/C485A回补 阅读提示：Fig. 3j–l、Fig. 4a–h图注及Results“Arylidene-indolinones covalently target DCAF11” |