iU-ExM方案开发与优化
建立迭代膨胀流程并优化变性和染色条件以获得均匀高倍膨胀。
测试不同交联剂（BIS vs DHEBA）和变性温度（73°C、85°C、95°C）对中心粒和弓形虫锥体膨胀的影响，采用85°C 1.5小时变性；比较扩张后染色与中间染色策略。
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iU-ExM：迭代超微结构膨胀显微镜实现细胞器与组织的纳米显微成像
iU-ExM: nanoscopy of organelles and tissues with iterative ultrastructure expansion microscopy.
实验完整度
高包含U2OS细胞、弓形虫、衣藻、小鼠视网膜组织及分离细胞核等多层级模型，并进行核孔对称性、锥体结构、纤毛周期性等功能与机制验证。
主要模型
U2OS细胞系及NUP96-GFP U2OS细胞 刚地弓形虫速殖子 莱茵衣藻CW15-株及分离基体 小鼠视网膜组织
重点核对
核孔复合物NUP96直径校准膨胀因子（参考值107 nm），iU-ExM观测到约16.8倍膨胀 弓形虫锥体直径（参考值380 nm）用于校准膨胀因子，并解析21 nm间距的螺旋微管纤维 DHEBA凝胶在85°C变性1小时30分钟，确保均匀膨胀并保留抗原性 中间免疫染色策略（第一轮凝胶内染色）显著提高信号强度和覆盖度 小鼠视网膜组织切片进行iU-ExM，CEP290沿连接纤毛呈现约58 nm周期性
摘要
膨胀显微镜（ExM）是一种高效的超分辨率荧光显微技术，利用常规荧光显微镜即可对生物样本进行超越衍射极限的成像。尽管已开发出多种改进方案，ExM尚未证明能够达到单分子定位显微镜（SMLM）等纳米显微技术的精度。为此，我们开发了迭代超微结构膨胀显微镜（iU-ExM）方法，实现了SMLM级别的分辨率。利用iU-ExM，现在可以可视化金标准样品的分子架构，例如核孔八重对称性或顶复门生物锥体的分子组织。凭借从分离细胞器到细胞和组织的广泛应用，iU-ExM为研究生物结构与功能的科学家开辟了新的超分辨率途径。当前膨胀显微镜方法需要进一步优化以达到纳米显微技术的精度。本文作者开发了迭代超微结构膨胀显微镜（iU-ExM）方法，实现了SMLM级分辨率。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过结合超微结构膨胀显微镜（U-ExM）与迭代膨胀，使传统荧光显微镜达到单分子定位显微镜（SMLM）级别的分辨率，并应用于细胞器与组织成像。
- 核心机制
- iU-ExM通过使用可裂解交联剂DHEBA进行第一轮凝胶膨胀，85°C变性实现均匀各向同性膨胀；中间免疫染色将抗体锚定于第一轮凝胶，再经第二轮非可裂解凝胶膨胀，实现约16倍分子膨胀，同时降低链接误差。
- 主要证据
- 在U2OS细胞中，iU-ExM分辨出核孔复合物八重对称性及NUP96角点；在弓形虫中解析锥体21 nm间距的螺旋微管纤维和22根皮质微管；在小鼠视网膜组织中揭示CEP290沿连接纤毛约58 nm周期性，这些结果均与SMLM或电镜数据一致。
- 研究意义
- iU-ExM利用常规荧光显微镜实现SMLM级分辨率，无需专用超分辨设备，可广泛应用于细胞器、细胞和组织水平的研究，为更广泛实验室研究亚细胞组织和分子架构提供新途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
核孔复合物八重对称性解析
评估iU-ExM分辨率是否达到SMLM水平。
使用NUP96-GFP U2OS细胞，经预提取固定后进行iU-ExM，以抗GFP和抗NUP96抗体标记，宽场和共聚焦成像，自动角点检测算法量化每个核孔的角点数。
弓形虫锥体分子架构解析
验证iU-ExM能否解析微管基结构的纳米级组织。
对弓形虫速殖子进行iU-ExM，标记微管蛋白、DCX-HA和SAS6-L-HA，分析锥体螺旋纤维间距、皮质微管数目及蛋白空间定位。
膜性细胞器成像
测试iU-ExM与不同固定方式（化学固定和冷冻固定）的兼容性。
U2OS细胞经PFA/GA固定后iU-ExM观察线粒体嵴间距；或经冷冻固定和冷冻置换后iU-ExM观察内质网管状结构。
小鼠视网膜组织膨胀与纤毛周期性分析
验证iU-ExM在组织水平上的适用性并解析连接纤毛分子组织。
小鼠视网膜整体包埋于第一轮凝胶，切片后进行iU-ExM，标记微管蛋白、POC5、CEP290、Centrin-2和LCA5，分析蛋白定位和周期性。
iU-ExM与TREx凝胶结合提升膨胀倍数
探索更高膨胀倍数的可行性。
将iU-ExM最终凝胶替换为TREx单体溶液，以弓形虫锥体、衣藻基体和核孔为分子标尺测量膨胀因子。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 固定 | 35-38%甲醛 | Merck–Sigma Aldrich | F8775 |
| 凝胶制备 | 丙烯酸钠 | AK Scientific | R624 |
| 细胞培养 | 含谷氨酰胺的DMEM培养基 | Thermo Fisher | 61965-026 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 10270 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher | 15140122 | |
| 多聚-D-赖氨酸 | Merck–Sigma Aldrich | A38904-01 | |
| 变性 | 十二烷基硫酸钠 | Pan Reac Applichem | A7219 |
| 细胞裂解 | NP-40裂解液 | Merck–Sigma Aldrich | I8896 |
| 免疫染色 | 吐温20 | Roth | 9127-2 |
| 牛血清白蛋白 | Merck–Sigma Aldrich | 10735086001 | |
| α微管蛋白单体 | ABCD Antibodies | AA344 | |
| β微管蛋白单体 | ABCD Antibodies | AA345 | |
| 人POC5抗体 | Bethyl | A303-341A | |
| GFP抗体 | Torrey Pine | TP401 | |
| NUP98-96抗体 | ProteinTech | 12329-1-AP | |
| NUP205抗体 | ProteinTech | 24439-1-AP | |
| 大鼠抗HA抗体 | Roche | 11 867 423 001 | |
| 视紫红质抗体 | Thermoscientific | MA5-11741 | |
| 小麦胚芽凝集素CF568 | Biotium | 29077-1 | |
| 蛋白标记 | NHS酯ATTO 594 | Atto-Tec | AD594-31 |
| 免疫染色 | 大鼠488二抗 | Invitrogen | A21208 |
| 兔488二抗 | Invitrogen | A11008 | |
| 小鼠488二抗 | Invitrogen | A11029 | |
| 小鼠568二抗 | Invitrogen | A11004 | |
| 豚鼠568二抗 | Invitrogen | A11075 | |
| Centrin抗体 | Millipore | 04-1624 | |
| LCA5抗体 | Proteintech | 19333-1-AP | |
| CEP290抗体 | Proteintech | 22490-1-AP |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 第一轮凝胶变性 | 变性温度85°C、时间1小时30分钟，使用DHEBA交联剂；温度偏差可导致各向异性或凝胶解体。 阅读提示：Methods中Iterative expansion的iU-ExM protocol第4步Denaturation。 |
| 中间免疫染色 | 在第一轮膨胀后、第二轮包埋前进行一抗和二抗孵育；一抗37°C 3小时（核孔4°C过夜），二抗37°C 3小时（核孔6小时）。 阅读提示：Methods中Labelling and immunostainings的iU-ExM intermediate staining小节。 |
| 核孔复合物成像 | 预提取固定方案（2.4% FA预固定30秒，0.4% Triton X-100透化3分钟，2.4% FA固定20分钟，0.2% Triton X-100二次透化10分钟）；NUP96-GFP U2OS细胞。 阅读提示：Methods中Fixation to visualize nuclear pores小节。 |
| 膨胀因子校准 | 核孔以NUP96直径107 nm校准；弓形虫锥体以380 nm校准；衣藻基体以225 nm校准；小鼠视网膜基体以230 nm校准。 阅读提示：Methods中Expansion factor measurement小节及对应Figure legends。 |
| 小鼠视网膜组织膨胀 | 成年C57BL/6J小鼠（2月龄）视网膜，4% PFA固定15分钟；第一轮凝胶DHEBA浓度加倍（0.2%），85°C变性2小时。 阅读提示：Methods中iU-ExM for mouse retina tissue expansion小节及Mouse retina小节。 |