AMBRA1动态的HDX-MS分析
探究AMBRA1的骨架灵活性及DDB1结合对AMBRA1动态的影响。
纯化全长AMBRA1单独或与Cullin4A-DDB1-RBX1复合物，进行HDX-MS，鉴定肽段并计算氘摄取。
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与细胞周期调控相关的DDB1-AMBRA1 E3连接酶受体复合物的结构
Structure of the DDB1-AMBRA1 E3 ligase receptor complex linked to cell cycle regulation.
实验完整度
高包含HDX-MS、冷冻电镜结构解析、体外泛素化、体外pull-down、细胞周期分析及免疫荧光等多层级功能与机制验证。
主要模型
HEK 293F/Expi293F细胞表达的AMBRA1WD40-DDB1复合物 sf9昆虫细胞表达的His6-DDB1 U2OS细胞系 体外纯化的Cyclin D1-CDK4复合物
重点核对
AMBRA1WD40构建体（残基1–204直接融合至853–1044）与DDB1共表达及共纯化 HDX-MS实验使用0.5 µM AMBRA1或AMBRA1-CUL4-DDB1-RBX1复合物，在25°C下交换10、30、60、300、900、1800秒 体外泛素化反应包含100 nM UBE1、1.5 µM UBCH5C、0.3 µM AMBRA1-DDB1-Cullin4-RBX1、20 µM HA-泛素、0.16 µM myc-Cyclin D1-CDK4和10 mM MgATP，37°C孵育2小时 U2OS细胞中siRNA敲低AMBRA1后回补野生型或突变体，通过流式细胞术分析细胞周期 U2OS细胞经100 nM AZD7762处理24小时后，通过免疫荧光定量γH2AX阳性细胞
摘要
AMBRA1是一种肿瘤抑制蛋白，作为泛素结合系统的底物受体，在自噬和细胞周期调控网络中发挥作用。AMBRA1的内在无序性迄今阻碍了其结构测定。为了解决这个问题，我们利用氢氘交换质谱（HDX-MS）分析了AMBRA1的动力学。HDX结果表明，AMBRA1是一种高度灵活的蛋白质，并且在与Cullin4A/B E3连接酶的衔接蛋白DDB1相互作用时可以被稳定。在此，我们展示了AMBRA1与DDB1复合物的3.08 Å分辨率冷冻电镜结构。该结构显示，AMBRA1中N端和C端结构区域的部分折叠在一起形成高度动态的WD40结构域，并揭示了DDB1如何与AMBRA1结合以创建用于底物募集的结合支架。AMBRA1的N端螺旋-环-螺旋基序和WD40结构域与DDB1的双螺旋桨折叠结合。我们还证明，DDB1结合缺陷型AMBRA1突变体在体外阻止底物Cyclin D1的泛素化并增加细胞周期进程。总之，这些结果提供了对AMBRA1-泛素连接酶复合物的结构见解，并提示了AMBRA1作为参与多种生理过程的枢纽的作用机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AMBRA1如何与DDB1结合并被稳定，以及该相互作用如何介导Cyclin D1泛素化和细胞周期调控。
- 核心机制
- AMBRA1的N端螺旋-环-螺旋基序和分裂的WD40结构域与DDB1的双螺旋桨折叠结合，形成底物募集支架；DDB1结合稳定AMBRA1的WD40结构域，促进Cyclin D1泛素化。
- 主要证据
- HDX-MS显示DDB1结合稳定AMBRA1的WD40结构域；3.08 Å冷冻电镜结构揭示AMBRA1WD40-DDB1界面；体外泛素化实验表明AMBRA1WD40足以促进Cyclin D1泛素化，而DDB1结合缺陷突变体（V10R、L13R等）丧失该活性；U2OS细胞中这些突变体导致细胞周期S期积累和DNA损伤增加。
- 研究意义
- 提供了AMBRA1-泛素连接酶复合物的结构见解，提示AMBRA1作为协调自噬、细胞周期等生理过程的枢纽机制，并可能为靶向AMBRA1功能相互作用的药物设计提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
AMBRA1WD40-DDB1复合物的冷冻电镜结构解析
解析AMBRA1与DDB1复合物的三维结构，揭示结合界面。
设计AMBRA1WD40构建体（残基1–204/853–1044）与DDB1在HEK 293F细胞中共表达，纯化复合物，制备冷冻电镜样品，收集数据并解析结构。
DDB1-AMBRA1相互作用的生化验证
验证AMBRA1 N端螺旋-环-螺旋基序及关键残基在DDB1结合中的作用。
通过MBP pull-down实验检测全长AMBRA1、N端缺失突变体及点突变体与His6-DDB1的结合。
AMBRA1WD40介导的Cyclin D1泛素化体外验证
验证AMBRA1WD40是否足以促进Cyclin D1泛素化，以及DDB1结合界面的重要性。
使用纯化的AMBRA1-DDB1-Cullin4-RBX1复合物、Cyclin D1-CDK4及泛素化级联组分进行体外泛素化反应，并通过SDS-PAGE和免疫印迹检测。
AMBRA1突变体对细胞周期和DNA损伤的影响
验证DDB1-AMBRA1界面突变对细胞周期进程和DNA损伤的影响。
在U2OS细胞中siRNA敲低AMBRA1后回补野生型或突变体，通过流式细胞术分析细胞周期，并通过免疫荧光检测γH2AX阳性细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白动态与结构
验证蛋白相互作用
验证细胞表型
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | Expi293F细胞 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Union-293培养基 | Union | -- | |
| 蛋白纯化 | Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | -- |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | -- | |
| HDX-MS | Orbitrap Eclipse质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| QExactive HFX质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 体外泛素化 | UBE1 | Boston Biochem | E-304 |
| UBCH5C | Boston Biochem | E2-627 | |
| HA-泛素 | Boston Biochem | U-110 | |
| MgATP溶液 | Boston Biochem | B-20 | |
| E3连接酶反应缓冲液 | Boston Biochem | B-71 | |
| 细胞培养 | Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | -- |
| X-tremeGENE HP DNA转染试剂 | Roche | -- | |
| 免疫印迹 | 抗AMBRA1抗体 | CST | 24907s |
| 免疫荧光 | 抗磷酸化组蛋白H2A.X (Ser139)抗体 | CST | 2577s |
| 免疫印迹 | 抗β-微管蛋白小鼠单克隆抗体 | Beyotime | AF2835 |
| 抗c-Myc小鼠单克隆抗体 | CWBIO | CW0299 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG | CWBIO | CW0102 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | CWBIO | CW0103 | |
| 免疫荧光 | AZD7762 | MedChemExpress | -- |
| 细胞培养 | Cellfectin II试剂 | Gibco | -- |
| 免疫印迹 | BeyoECL Plus | Beyotime | -- |
| 免疫荧光 | 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime | -- |
| 流式细胞术 | 含RNaseA的PI染色缓冲液 | Beyotime | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HDX-MS分析 | AMBRA1或复合物浓度0.5 µM；交换时间点10、30、60、300、900、1800秒；温度25°C；缓冲液组成（20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2） 阅读提示：Methods中“Hydrogen—deuterium exchange mass spectrometry (HDX)”小节 |
| 冷冻电镜结构解析 | AMBRA1WD40构建体（残基1–204/853–1044）；蛋白浓度0.15–0.2 mg/ml；Titan Krios 300 kV；像素大小0.85 Å；总剂量58.96 e−/Å2 阅读提示：Methods中“Cryo-EM grid preparation and data acquisition”及“Cryo-EM data processing”小节 |
| 体外泛素化实验 | UBE1 100 nM；UBCH5C 1.5 µM；AMBRA1-DDB1-Cullin4-RBX1 0.3 µM；HA-泛素 20 µM；myc-Cyclin D1-CDK4 0.16 µM；MgATP 10 mM；37°C孵育2小时 阅读提示：Methods中“In vitro ubiquitination assay”小节 |
| 细胞周期分析 | U2OS细胞8×10^4细胞/孔；siRNA转染后48小时回补质粒；转染后48小时收获；流式细胞术记录约2×10^4细胞；n=3生物学重复 阅读提示：Methods中“Cell cycle analysis”小节及Fig. 4b图注 |
| DNA损伤检测 | U2OS细胞5×10^4细胞/孔；AZD7762处理浓度100 nM，24小时；γH2AX抗体1:1000稀释；每组计数约300细胞；n=3生物学重复 阅读提示：Methods中“Immunoblotting and immunofluorescence”小节及Fig. 4c,d图注 |