生物信息学与细胞水平线粒体功能表型验证
验证ZHX2是否调控线粒体质量和OXPHOS。
在Huh7细胞中过表达或敲低ZHX2，检测mtDNA拷贝数、Mito Tracker深红荧光、JC-1聚集体、OCR及ATP/AMP/ADP水平；并在人肝类器官和小鼠原代肝细胞中验证ZHX2敲低/敲除的效应。
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ZHX2在急性肝损伤中作为线粒体氧化磷酸化的负调控因子
ZHX2 emerges as a negative regulator of mitochondrial oxidative phosphorylation during acute liver injury.
实验完整度
高含体外细胞系、类器官、原代肝细胞、多种小鼠模型、多组学、ChIP及患者肝组织验证，并有功能与机制验证
主要模型
Huh7细胞系 人肝类器官 小鼠原代肝细胞 肝细胞特异性Zhx2敲除小鼠
重点核对
Zhx2-KOhep小鼠与Zhx2-WT小鼠在2/3 PHx后36、48、96 h的肝/体重比和BrdU阳性细胞数（每组n=5） CCl4（10% 10 μL/g）处理后24、48、72 h的血清ALT/AST和TUNEL阳性细胞（每组n=4–6） Metformin（400 mg/kg/day，腹腔注射，预处理72 h）对Zhx2-KOhep小鼠2/3 PHx后肝再生的影响（每组n=4） SR18292（50 mg/kg/day，腹腔注射，预处理48 h）对Zhx2-KOhep小鼠2/3 PHx后肝再生的影响（每组n=4） DILI患者肝活检（n=27）与肝血管瘤正常对照（n=4）中ZHX2和TOM20的免疫荧光强度及Pearson相关性
摘要
线粒体功能障碍参与急性肝损伤，而线粒体调节因子如PGC-1α和MCJ影响肝再生。因此，鉴定线粒体调节因子可能为开发治疗策略铺平道路。本文鉴定出ZHX2是急性肝损伤中的线粒体调节因子。ZHX2在转录水平抑制多个线粒体电子传递链基因的表达，并降低PGC-1α的稳定性，导致线粒体质量和OXPHOS减少。在部分肝切除或CCl4诱导肝损伤的小鼠中，Zhx2缺失通过增加线粒体OXPHOS促进肝脏恢复，而抑制PGC-1α或电子传递链可消除这些效应。值得注意的是，药物性肝损伤患者肝组织中ZHX2表达较高，且与线粒体质量标志物TOM20呈负相关。递送靶向Zhx2的shRNA可有效保护小鼠免受CCl4诱导的肝损伤。总之，我们的数据阐明了ZHX2作为线粒体OXPHOS的负调控因子，并可能成为改善急性损伤后肝脏恢复策略的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ZHX2是否参与急性肝损伤后线粒体功能和肝脏修复的调控，以及其作用机制是什么。
- 核心机制
- ZHX2一方面通过结合ETC基因启动子中的共识基序（AGGCTGAG）转录抑制部分ETC基因表达，另一方面通过上调FBXW7促进PGC-1α泛素化降解，从而降低线粒体质量和OXPHOS。
- 主要证据
- 在Huh7细胞、人肝类器官和原代肝细胞中，ZHX2过表达降低而敲低/敲除增加线粒体质量、膜电位、OCR和ATP生成；在2/3 PHx和CCl4小鼠模型中，Zhx2缺失加速肝修复并增强OXPHOS，metformin、FCCP或SR18292处理可消除这些效应；ChIP-seq、ChIP-qPCR、双荧光素酶和EMSA证实ZHX2结合ETC基因启动子；CHX追踪、MG132处理和泛素化实验证实ZHX2经FBXW7促进PGC-1α降解；DILI患者肝组织中ZHX2与TOM20呈负相关。
- 研究意义
- 本研究将ZHX2鉴定为线粒体OXPHOS的负调控因子和急性肝损伤后肝脏修复的潜在治疗靶点，为改善急性肝损伤（如DILI和肝切除）后的肝脏恢复提供了策略方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
急性肝损伤小鼠模型的肝修复表型评估
验证Zhx2缺失是否促进急性肝损伤后的肝脏修复。
对Zhx2-KOhep和Zhx2-WT小鼠进行2/3 PHx或CCl4注射，检测肝/体重比、细胞周期基因和PCNA表达、BrdU阳性细胞、血清ALT/AST、H&E坏死面积及TUNEL阳性细胞。
多组学分析损伤肝修复中的线粒体代谢变化
解析Zhx2缺失促进肝修复的代谢和线粒体通路变化。
对2/3 PHx后48 h的Zhx2-KOhep和Zhx2-WT小鼠肝组织进行RNA-seq、定量蛋白质组学和能量代谢组学，并进行GSEA、GSVA和KEGG分析。
OXPHOS抑制剂对Zhx2缺失促肝修复效应的功能挽救
验证Zhx2缺失通过增强OXPHOS促进肝修复。
用metformin或FCCP预处理Zhx2-KOhep和Zhx2-WT小鼠后进行2/3 PHx，检测肝/体重比、PCNA/Cyclin A2/Cyclin D1表达、BrdU阳性细胞及ATP/AMP水平；并在Huh7细胞中验证metformin对ZHX2敲低效应的逆转。
ZHX2转录抑制ETC基因的机制验证
验证ZHX2是否直接结合ETC基因启动子并抑制其转录。
在ZHX2-HA过表达Huh7细胞中进行ChIP-seq和ChIP-qPCR，结合RNA-seq筛选重叠的ETC基因；用双荧光素酶报告、EMSA和生物素pull-down验证ZHX2与共识基序（AGGCTGAG）的结合。
ZHX2经FBXW7促进PGC-1α降解的机制验证
阐明ZHX2降低PGC-1α蛋白水平的分子途径。
用CHX追踪实验检测PGC-1α半衰期，用MG132和CQ处理判断降解途径，用泛素化实验检测PGC-1α泛素化，并通过siFBXW7挽救实验验证FBXW7的中介作用。
PGC-1α在ZHX2抑制肝修复中的功能验证
验证ZHX2是否通过PGC-1α依赖方式抑制OXPHOS和肝修复。
在Huh7细胞中共转染ZHX2和PGC-1α或siPGC-1α，检测mtDNA、Mito Tracker、JC-1、OCR和ETC基因表达；用PGC-1α抑制剂SR18292预处理Zhx2-KOhep和Zhx2-WT小鼠后进行2/3 PHx，检测肝/体重比、PCNA/Cyclin A2/Cyclin D1、BrdU和ATP/AMP。
DILI患者样本验证及shZhx2治疗潜力评估
在人类样本中验证ZHX2与线粒体质量的关联，并评估沉默Zhx2对CCl4诱导肝损伤的保护作用。
对DILI患者（n=27）和肝血管瘤正常对照（n=4）肝组织进行ZHX2和TOM20多重免疫荧光及Pearson相关分析；对C57BL/6小鼠尾静脉高压注射pSilencer-shZhx2或对照载体，5天后CCl4损伤，检测H&E、Ki67、TUNEL及血清ALT、AST、ALP、TBL、TBA、GGT。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | TIANGEN Biotech | DP424 |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1622 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme Biotech | Q711 | |
| Western blot | 细胞裂解液 | Beyotime | P0013 |
| BCA蛋白定量试剂 | Beyotime | P0009 | |
| Immobilon-P膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 抗ZHX2抗体 | Proteintech | 20136-1-AP | |
| 抗PGC-1α抗体 | Proteintech | 66369-1-Ig | |
| 抗FBXW7抗体 | Abcam | ab109617 | |
| 增强化学发光试剂 | Millipore | WBULS0500 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | GIBCO | C11995500BT |
| 胎牛血清 | BI | 10270-106 | |
| SR18292 | MCE | HY-101491 | |
| 原代肝细胞培养 | Williams’ E培养基 | Thermo Fisher Scientific | 22551089 |
| 青霉素/链霉素 | Solarbio | p1400 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 类器官培养 | AdDMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| ChIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| 表皮生长因子 | Peprotech | 100-47 | |
| 转化生长因子α | Peprotech | 100-16A | |
| 成纤维细胞生长因子7 | Peprotech | 100-19 | |
| 肝细胞生长因子 | Peprotech | 100-39H | |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | |
| 制瘤素M | Sigma | O9635 | |
| 质粒构建 | pGL3启动子载体 | Promega | E1761 |
| TUNEL实验 | 原位细胞死亡检测试剂盒（荧光素） | Roche | 11684795910 |
| Ki67染色 | 柠檬酸钠抗原修复液 | Solarbio | C1032 |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 免疫荧光染色 | 抗BrdU抗体 | Abcam | ab6326 |
| 含DAPI的ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Beyotime | C1002 | |
| 多重免疫荧光染色 | Opal化学染色试剂盒 | AKOYA | NEL861001KT |
| 超分辨显微成像 | 抗TOM20抗体 | Abclonal | A19403 |
| OCR测定 | 寡霉素 | -- | -- |
| FCCP | -- | -- | |
| 鱼藤酮 | -- | -- | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 细胞外氧消耗实验 | 氧消耗试剂盒 | Abcam | ab197243 |
| Oroboros 2K氧耗测定 | 苹果酸 | Sigma-Aldrich | M1000 |
| ADP | Sigma-Aldrich | 117105 | |
| 琥珀酸 | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告检测系统 | Promega | E1960 |
| EMSA | 核提取试剂盒 | Beyotime | P0028 |
| Light Shift化学发光EMSA试剂盒 | Beyotime | GS009 | |
| 生物素化pull-down实验 | 链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 11205D |
| 免疫沉淀 | 蛋白G磁珠 | Bimake | B23202 |
| mtDNA含量测定 | TIANGEN基因组DNA纯化试剂盒 | TIANGEN | DP304 |
| ATP/AMP测定 | ATP测定试剂盒 | Abcam | ab83355 |
| AMP测定试剂盒 | Abcam | ab273275 | |
| ATP/ADP测定 | ADP/ATP比值测定试剂盒 | Abcam | ab65313 |
| 流式细胞术 | Mito Tracker深红FM探针 | Thermo Fisher Scientific | M22426 |
| MitoProbe™ JC-1 | Thermo Fisher Scientific | M34152 | |
| MitoProbe™ TMRM | Thermo Fisher Scientific | M20036 | |
| ChIP和ChIP-qPCR | EZ-Magna ChIP™ A/G染色质免疫沉淀试剂盒 | Millipore | 17-10086 |
| 抗HA抗体 | MBL | M180-3 | |
| 兔IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| 泛素化分析 | MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 |
| 原代肝细胞分离 | HBSS缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 14175095 |
| IV型胶原酶 | Worthington | LS004189 | |
| 类器官培养 | 基质胶 | Bio-Techne | BME001 |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | GeneChem | REVG0001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 2/3部分肝切除模型 | 小鼠年龄8–12周、麻醉剂1%戊巴比妥钠、切除左外侧叶和中介叶、取材时间点36/48/96 h及7天、每组n=5 阅读提示：Methods中“Partial hepatectomy and CCl4 injection”及Fig. 2a–c图注 |
| CCl4诱导肝损伤模型 | CCl4浓度10%、剂量10 μL/g、给药途径（文中未明确说明）、取材时间24/48/72 h、每组n=4–6 阅读提示：Methods中“Partial hepatectomy and CCl4 injection”及Fig. 2d–g图注 |
| Metformin预处理2/3 PHx模型 | Metformin剂量400 mg/kg/day、溶剂PBS、腹腔注射、预处理72 h、2/3 PHx后36和48 h取材、每组n=3–4 阅读提示：Methods中“Mouse experiments”及Fig. 4c–g图注 |
| FCCP预处理2/3 PHx模型 | FCCP剂量2 mg/kg/day、溶剂DMSO、腹腔注射、预处理72 h、2/3 PHx后36和48 h取材、每组n=4 阅读提示：Methods中“Mouse experiments”及Supplementary Fig. 4 |
| SR18292预处理2/3 PHx模型 | SR18292剂量50 mg/kg/day、溶剂2% DMSO in PBS、腹腔注射、预处理48 h、2/3 PHx后36和48 h取材、每组n=3–4 阅读提示：Methods中“Mouse experiments”及Fig. 7e–i图注 |
| shZhx2尾静脉高压注射与CCl4损伤 | pSilencer-shZhx2剂量15 μg、注射后5天给予CCl4（10% 10 μL/g）、CCl4后24和48 h取材、每组n=4 阅读提示：Methods中“Partial hepatectomy and CCl4 injection”及Fig. 8e–i图注 |
| DILI患者样本免疫荧光分析 | DILI患者n=27（齐鲁医院12例、北京地坛医院15例）、正常对照n=4、DILI严重程度分组（轻/中/重/致命）、ZHX2与TOM20荧光强度Pearson相关分析 阅读提示：Methods中“Human samples”及Fig. 8a–d图注、Supplementary Table 1 |
| ChIP-seq和ChIP-qPCR | ZHX2-HA过表达Huh7细胞、anti-HA抗体（MBL M180-3）、对照兔IgG（Santa Cruz sc-2027）、DNA超声片段200–1000 bp、共识基序AGGCTGAG 阅读提示：Methods中“Chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-qPCR”及“ChIP sequencing (ChIP-seq)” |