PRDM16相互作用蛋白鉴定
寻找米色脂肪中调控PRDM16活性的因子。
从scWAT分化的米色脂肪细胞中免疫纯化PRDM16复合物并进行质谱鉴定，通过co-IP验证PRDM16与YAP/TAZ的相互作用及结合结构域。
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YAP/TAZ-S100B轴转录抑制米色脂肪神经支配
Transcriptional repression of beige fat innervation via a YAP/TAZ-S100B axis.
实验完整度
高包含细胞模型、多种基因修饰小鼠模型、AAV局部干预及患者数据再分析，并进行了功能与机制验证
主要模型
SVF来源的米色脂肪细胞 HEK-293T细胞 脂肪细胞特异性Yap/Taz敲除小鼠（YT-AKO、YT-iAKO） HFD诱导肥胖及老龄小鼠模型
重点核对
脂肪细胞特异性Yap/Taz敲除效率（scWAT和BAT中YAP/TAZ蛋白下降） YAP/TAZ与PRDM16 ZF2结构域相互作用及与C/EBPβ的竞争结合 S100b敲除对Yap/Taz缺失诱导的交感神经支配和UCP1表达的阻断 冷暴露或NE/FSK处理下YAP/TAZ磷酸化及核质转位 AAV-ADP-S100b在eWAT过表达对肥胖和葡萄糖稳态的影响
摘要
交感神经支配对于维持体温和代谢稳态的功能性米色脂肪的发育至关重要，然而控制这种神经支配的分子机制在很大程度上仍不清楚。在这里，我们发现脂肪细胞YAP/TAZ通过转录抑制神经营养因子S100B来抑制米色脂肪的交感神经支配。脂肪细胞特异性缺失Yap/Taz诱导S100b表达，从而刺激皮下白色脂肪组织（WAT）和抗棕色化内脏WAT中功能性米色脂肪的交感神经支配和生物发生。机制上，YAP/TAZ与C/EBPβ竞争结合PRDM16的锌指-2结构域以抑制S100b转录，而肾上腺素能刺激的YAP/TAZ磷酸化和失活可解除这种抑制。重要的是，脂肪细胞中Yap/Taz缺失或内脏WAT中AAV-S100B过表达可限制年龄相关和饮食诱导的肥胖，并通过增强小鼠能量消耗改善代谢稳态。总之，我们的数据揭示YAP/TAZ通过阻断PRDM16-C/EBPβ介导的S100b表达，充当米色脂肪神经支配的刹车。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脂肪细胞YAP/TAZ是否以及如何调控米色脂肪的交感神经支配和生物发生。
- 核心机制
- YAP/TAZ通过其与PRDM16 ZF2结构域结合，竞争性阻碍PRDM16-C/EBPβ复合物形成，从而转录抑制神经营养因子S100b表达；冷诱导的肾上腺素能-cAMP-PKA信号使YAP/TAZ磷酸化并滞留于胞质，解除对S100b的抑制。
- 主要证据
- 利用脂肪细胞特异性Yap/Taz敲除小鼠、AAV介导的局部基因敲除/过表达、co-IP、CUT&Tag-qPCR、RNA-seq及代谢表型分析，证明Yap/Taz缺失或S100B过表达增加交感神经支配、促进米色脂肪生成和能量消耗，并改善年龄相关及饮食诱导的肥胖和葡萄糖稳态。
- 研究意义
- 揭示YAP/TAZ作为米色脂肪神经支配的刹车，靶向YAP/TAZ-S100B轴可能成为治疗饮食诱导或年龄相关肥胖及其代谢紊乱的有效策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
脂肪细胞Yap/Taz缺失对米色脂肪生成的影响
验证YAP/TAZ在 adaptive thermogenesis 中的功能。
构建脂肪细胞特异性Yap/Taz敲除小鼠，通过RNA-seq、RT-qPCR、免疫印迹、H&E染色及代谢笼分析检测scWAT和BAT中产热基因表达、形态及能量代谢。
YAP/TAZ调控S100B表达及交感神经支配
确定Yap/Taz缺失诱导米色化的非脂肪细胞自主机制。
利用Adipo-Clear和3D成像观察交感神经支配，通过AAV在scWAT过表达S100B或联合敲除Yap/Taz与S100b，检测神经支配和UCP1表达。
YAP/TAZ-PRDM16-C/EBPβ机制解析
阐明YAP/TAZ抑制S100b转录的分子机制。
通过ChIP-seq数据分析、CUT&Tag-qPCR、co-IP及报告基因实验，验证PRDM16和C/EBPβ结合S100b启动子及YAP/TAZ竞争性破坏复合物形成。
肾上腺素能信号对YAP/TAZ的调控
探究冷暴露诱导S100B表达的 upstream 信号。
用NE、FSK、H89及CL-316,243处理米色脂肪细胞，检测YAP/TAZ磷酸化、核质分布及PRDM16-C/EBPβ复合物形成；在体验证冷暴露和TAZ(4SA)表达的影响。
Yap/Taz缺失及S100B过表达对肥胖和代谢的改善
评估靶向YAP/TAZ-S100B轴的治疗潜力。
在老龄小鼠和HFD诱导肥胖小鼠中，通过脂肪细胞特异性Yap/Taz敲除或eWAT注射AAV-ADP-S100b，检测体重、脂肪量、葡萄糖耐量、胰岛素耐量、能量消耗及交感神经支配。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物饲养 | 正常维持饲料 | Xietong Shengwu | 1010063 |
| HFD诱导肥胖模型 | 高脂饲料 | Research Diets | D12492 |
| 诱导性基因敲除 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | -- |
| 原代前脂肪细胞分离 | I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| SVF分离 | I型胶原酶 | Worthington | -- |
| RNA提取 | TRIzol | Sigma-Aldrich | -- |
| 逆转录 | 5×All-In-One MasterMix试剂盒 | abm | -- |
| RT-qPCR | ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- |
| CUT&Tag | Hyperactive Universal CUT&Tag检测试剂盒 | Vazyme | TD903 |
| 抗PRDM16抗体 | R&D | AF6295 | |
| 抗C/EBPβ抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7962x | |
| 免疫印迹 | 抗UCP1抗体 | Sigma-Aldrich | U6382 |
| 抗PRDM16抗体 | R&D | AF6295 | |
| 抗C/EBPβ抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7962x | |
| 抗Perilipin抗体 | Vala Science | 4854 | |
| 抗磷酸化Perilipin（Ser522）抗体 | Vala Science | 4856 | |
| 抗Lamin B1抗体 | Protein Tech | 66095-1-Ig | |
| 抗α-tubulin抗体 | Sigma-Aldrich | T6199 | |
| 抗TH抗体 | Millipore | AB1542 | |
| 抗HSP90α/β抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13119 | |
| 抗Flag抗体 | Abmart | 293881 | |
| 山羊抗小鼠IgG:HRP | Thermo Scientific | 32430 | |
| 山羊抗兔IgG:HRP | Thermo Scientific | 31460 | |
| 驴抗羊IgG:HRP | R&D | HAF016 | |
| 抗YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 4912 | |
| 抗YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| 抗TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 4883 | |
| 抗TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 83669 | |
| 抗磷酸化YAP（Ser112）抗体 | Cell Signaling Technology | 4911 | |
| 抗磷酸化TAZ（Ser89）抗体 | Cell Signaling Technology | 59971 | |
| 抗HSL抗体 | Cell Signaling Technology | 4107 | |
| 抗磷酸化HSL（Ser660）抗体 | Cell Signaling Technology | 4126 | |
| 抗S100B抗体 | Cell Signaling Technology | 9550 | |
| 抗C/EBPα抗体 | Cell Signaling Technology | 2295 | |
| 抗PPARγ抗体 | Cell Signaling Technology | 2435 | |
| 抗PKA底物抗体 | Cell Signaling Technology | 9624 | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 免疫共沉淀 | 抗HA磁珠 | Thermo Fisher Science | 88836 |
| Protein G磁珠 | Cell Signaling Technology | 37478 | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG琼脂糖珠 | Smart Lifesciences | SA042001 |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD™可固定紫色死细胞染色剂 | Thermo Scientific | L34955 |
| 抗CD16/32抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗CD45-APC Cy7抗体 | BioLegend | 103116 | |
| 抗F4/80-FITC抗体 | Cell Signaling | 52267 | |
| 抗CD11c-AF647抗体 | BioLegend | 117314 | |
| 抗CD206-PE Cy7抗体 | BioLegend | 141720 | |
| 细胞免疫荧光 | Alexa Fluor 488标记抗羊抗体 | Invitrogen | A11015 |
| Alexa Fluor 594标记抗兔抗体 | Abcam | ab150080 | |
| 全组织免疫染色 | 抗TH抗体 | Millipore | AB1542 |
| 抗UCP1抗体 | Abcam | ab10983 | |
| Alexa Fluor 488标记抗羊抗体 | Invitrogen | A11015 | |
| Alexa Fluor 488标记抗兔抗体 | Cell Signaling Technology | 4412 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 脂肪细胞特异性Yap/Taz敲除 | 他莫昔芬剂量100 mg/kg，腹腔注射，每两天一次共3次（条件性敲除）或每天一次共5次（HFD模型）；8周龄雄性小鼠；敲除后4周取材 阅读提示：Methods中Mice小节 |
| 冷暴露与体温检测 | 冷暴露温度4°C，时间2天或7天；核心体温用直肠探头监测；体温低于30°C时 euthanize 阅读提示：Methods中Body temperature measurement小节及图2、图5图注 |
| CL-316,243刺激能量消耗 | CL-316,243剂量1 mg/kg体重，腹腔注射；30°C适应1天 阅读提示：Methods中CL-316,243-induced energy expenditure小节 |
| AAV介导的基因敲除或过表达 | AAV血清型RC2/8用于体内；AAV-ADP-S100b注射scWAT或eWAT 3-4周；AAV-tandem gRNA在Rosa26-LSL-Cas9;AdipoqCre小鼠局部注射 阅读提示：Methods中AAV and lentivirus production小节及图3、图5、图8图注 |
| 葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验 | GTT：禁食8小时，葡萄糖2 g/kg体重腹腔注射；ITT：禁食6小时，胰岛素0.7 U/kg（ND年轻）、1 U/kg（ND老年）、1.5 U/kg（HFD）腹腔注射 阅读提示：Methods中Glucose homeostasis test in mice小节 |