高通量筛选与先导化合物优化
发现并优化选择性激活HsClpP的小分子化合物。
对3896个化合物进行基于荧光强度的蛋白酶活性高通量筛选，发现BX471；通过合成优化获得ZK11和ZK53，并以ZK24为阴性对照。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
人ClpP选择性激活剂触发细胞周期阻滞抑制肺鳞状细胞癌
Selective activator of human ClpP triggers cell cycle arrest to inhibit lung squamous cell carcinoma.
实验完整度
高包含体外酶活、晶体结构、细胞功能、组学分析及异种移植和自发小鼠模型等多层级证据，并有功能与机制验证
主要模型
人肺鳞癌细胞系H1703、H520、SK-MES-1、H226 Balb/c裸鼠H1703细胞异种移植模型 KrasLSL-G12D/+;Lkb1fl/fl基因工程小鼠模型
重点核对
ZK53对HsClpP的EC50为1.37 μM（PAGE法）和0.22 μM（FI法），对SaClpP和EcClpP激活极弱 ZK53与HsClpP结合的晶体结构分辨率1.9 Å（PDB: 8HGK），W146与3,5-二氟苄基形成π-π堆积 W146I HsClpP突变使ZK53的EC50从1.4升至11.8 μM，I91W SaClpP突变使EC50从44.5降至5.4 μM 异种移植模型：ZK53 80 mg/kg腹腔注射，每日两次，每周五天；KL小鼠模型治疗4周 RNA-seq：H1703细胞经1 μM ZK53处理48 h，约1990个差异表达基因
摘要
线粒体ClpP的化学激活表现出有前景的抗癌特性。然而，我们目前尚不清楚有任何研究在肺鳞状细胞癌中使用选择性且强效的ClpP激活剂。在本工作中，我们报道了这样一种激活剂ZK53，它在体内对肺鳞状细胞癌表现出治疗效果。ZK53/ClpP复合物的晶体结构揭示了一种π-π堆积效应，该效应对于配体选择性结合线粒体ClpP至关重要。ZK53具有简单的骨架特征，这与具有刚性骨架的激活剂（如酰基缩肽和咪唑吡啶酮）不同。ZK53处理导致电子传递链以ClpP依赖的方式减少，从而导致肺肿瘤细胞中氧化磷酸化和ATP产生下降。在机制上，ZK53抑制腺病毒早期区域2结合因子靶标并激活ATM介导的DNA损伤反应，最终触发细胞周期阻滞。最后，ZK53在异种移植和自发小鼠模型中均对肺鳞状细胞癌细胞表现出治疗效果。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探究选择性且强效的人ClpP激活剂在肺鳞状细胞癌中的治疗作用及其分子机制。
- 核心机制
- ZK53通过π-π堆积效应选择性结合并激活HsClpP，导致线粒体电子传递链亚基等蛋白降解，抑制氧化磷酸化和ATP产生；同时抑制E2F靶标并激活ATM介导的DNA损伤反应，最终引发细胞周期阻滞。
- 主要证据
- 体外酶活实验显示ZK53选择性激活HsClpP；晶体结构揭示W146介导的选择性结合；LUSC细胞中ZK53引起ETC亚基降解、OCR下降、MMP和ATP降低、ROS升高；RNA-seq和免疫印迹显示E2F靶标下调和ATM-DDR激活；异种移植和KL小鼠模型证实ZK53抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 本研究报道了选择性HsClpP激活剂ZK53在LUSC中的抗癌效果，表明通过进化简化开发选择性HsClpP激活剂是一种有前景的策略，并有助于进一步研究HsClpP作为靶向抗癌治疗靶点的可成药性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外选择性激活验证
验证化合物对HsClpP与细菌ClpP的选择性激活作用。
使用PAGE法和FI法检测ZK11、ZK53对HsClpP、SaClpP、EcClpP和LrClpP的α-酪蛋白或FITC-酪蛋白水解活性；用DSF检测热稳定性变化。
晶体结构解析与选择性机制验证
揭示ZK53与HsClpP的结合模式及选择性分子基础。
解析ZK53/HsClpPΔ56复合物晶体结构（1.9 Å）；构建W146I HsClpP和I91W SaClpP突变体，通过PAGE和DSF验证π-π堆积效应。
细胞水平抗癌活性评估
评估ZK53对LUSC细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。
用MTT、克隆形成、EdU掺入、流式细胞术检测细胞活力和细胞周期；用Annexin V-FITC/PI检测凋亡；通过shRNA敲低和过表达CLPP验证靶点依赖性。
线粒体功能与靶点结合验证
验证ZK53对线粒体功能的影響及细胞内靶点结合。
免疫印迹检测ETC亚基；Seahorse分析OCR；JC-1检测MMP；ATP检测试剂盒测定ATP；MitoSOX检测线粒体ROS；CETSA检测细胞内HsClpP热稳定性。
转录组与信号通路机制解析
探究ZK53抑制LUSC细胞增殖的分子机制。
对1 μM ZK53处理48 h的H1703细胞进行RNA-seq，KEGG/Reactome富集、GSEA和GSVA分析；qPCR和免疫印迹验证E2F靶标和ATM-DDR通路；使用ATM抑制剂KU-55933和AZD1390验证通路。
体内抗肿瘤疗效评估
验证ZK53在动物模型中对LUSC的治疗效果。
建立H1703细胞Balb/c裸鼠异种移植模型，腹腔注射ZK53；使用KrasLSL-G12D/+;Lkb1fl/fl基因工程小鼠模型，经鼻吸入Ad-Cre诱导肿瘤后给予ZK53；检测肿瘤体积、重量、Ki67和H&E染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化与结晶 | 四水醋酸镁 | -- | -- |
| 聚乙二醇3350 | -- | -- | |
| ClpP酶活实验 | α-酪蛋白 | Sigma | C0528 |
| FITC标记酪蛋白 | Sigma | -- | |
| DSF实验 | SYPROTM Orange染料 | Invitrogen | S11368 |
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 慢病毒感染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668500 |
| 聚凝胺 | Genomeditech | GM-040901A | |
| 嘌呤霉素 | Meilune | MB2005 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C |
| BCA蛋白测定试剂盒 | Beyotime | P0009 | |
| 硝酸纤维素膜 | Millipore | -- | |
| Chemistar Western Blotting底物 | Tanon | -- | |
| qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| HiScript III RT SuperMix for qPCR试剂盒 | Vazyme | R233-01 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711-02 | |
| 细胞增殖实验 | MTT溶液 | Meilunbio | MA0198 |
| EdU增殖实验 | EdU细胞增殖检测试剂盒（Alexa Fluor 488） | Meilunbio | MA0424-1 |
| 细胞周期分析 | 细胞周期与凋亡分析试剂盒 | Meilunbio | MA0334 |
| 凋亡分析 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Meilunbio | MA0220 |
| 细胞外流量分析 | Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | 103015-100 |
| Seahorse XFe96分析仪 | Agilent | -- | |
| 线粒体膜电位测定 | 增强型线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1） | Beyotime | C2003S |
| ATP水平测定 | 增强型ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0027 |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX线粒体超氧化物指示剂 | Invitrogen | M36005 |
| 线粒体DNA拷贝数测定 | DNeasy血液与组织DNA提取试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 |
| FITC标记二抗 | Invitrogen | A11034 | |
| DAPI染料 | Invitrogen | 62248 | |
| 碱性彗星实验 | OxiSelect™彗星实验试剂盒 | Cell Biolabs | STA-351-5 |
| 异种移植模型 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| 抗体 | HsClpP抗体 | Abcam | ab124822 |
| NDUFB8抗体 | Abcam | ab192878 | |
| SDHA抗体 | Proteintech | 66588-1-Ig | |
| UQCRC2抗体 | Abcam | ab203832 | |
| COX IV抗体 | Abcam | ab153709 | |
| 磷酸化Rb S795抗体 | Abclonal | AP0088 | |
| 磷酸化Rb T826抗体 | Abcam | ab133446 | |
| 磷酸化Rb S807/811抗体 | CST | 8516T | |
| Cyclin D1抗体 | Abcam | ab134175 | |
| Cyclin E2抗体 | Abclonal | A9305 | |
| CDK2抗体 | Abclonal | A0294 | |
| PCNA抗体 | Abclonal | A12427 | |
| γ-H2AX抗体 | CST | 9718S | |
| 磷酸化ATM S1981抗体 | Abcam | ab81292 | |
| 磷酸化CHK2 T68抗体 | CST | 2197T | |
| CDC25A抗体 | Santa Cruz | sc-7389 | |
| Ki67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| SOX2抗体 | Abcam | ab92494 | |
| 细胞角蛋白5（KRT5）抗体 | Bioworld | BS1208 | |
| p40抗体 | MXB Biotechnologies | RMA-0815 | |
| TTF1抗体 | Abcam | ab133638 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 化合物处理与细胞活力检测 | ZK53浓度、处理时间（72 h）、细胞接种密度（1500–5000细胞/孔） 阅读提示：Methods中Cell proliferation assays小节及Figure 3e图注 |
| ClpP酶活实验 | HsClpP浓度0.2 mg/mL、α-酪蛋白0.6 mg/mL、37°C孵育2 h；FI法0.7 μM HsClpP、5 μM FITC-酪蛋白 阅读提示：Methods中ClpP enzymatic assays小节 |
| 异种移植模型 | H1703细胞接种量7×10^6/只、Matrigel比例50%、ZK53剂量80 mg/kg、腹腔注射每日两次每周五天、分组随机 阅读提示：Methods中Xenograft mice model小节及Figure 6a图注 |
| 基因工程小鼠模型 | KrasLSL-G12D/+;Lkb1fl/fl小鼠6–8周龄、Ad-Cre剂量2×10^6 p.f.u经鼻吸入、ZK53治疗4周 阅读提示：Methods中Genetically engineered mouse model小节及Figure 6e图注 |
| RNA-seq与通路分析 | ZK53浓度1 μM、处理时间48 h、H1703细胞、差异基因数约1990 阅读提示：Methods中RNA-sequencing小节及Results中ZK53 inhibits the adenoviral early region 2 binding factor (E2F) targets部分 |