检测肾纤维化中蛋白质棕榈酰化水平变化
明确肾纤维化时蛋白质棕榈酰化是否发生改变
利用ABE assay和Click-iT化学荧光检测UUO或IRI小鼠肾脏中蛋白质棕榈酰化水平；腹腔注射标记的棕榈酸观察纤维化区域棕榈酰化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
棕榈酰转移酶DHHC9和酰基蛋白硫酯酶APT1通过调节β-catenin棕榈酰化调控肾纤维化
Palmitoyltransferase DHHC9 and acyl protein thioesterase APT1 modulate renal fibrosis through regulating β-catenin palmitoylation.
实验完整度
高包含体外原代肾小管细胞、多种小鼠模型（UUO、IRI、基因敲除/过表达）及患者肾组织样本，并有功能验证和机制验证。
主要模型
原代小鼠肾小管上皮细胞（PTCs） UUO诱导的小鼠肾纤维化模型 IRI诱导的小鼠肾纤维化模型 CKD患者肾组织样本
重点核对
小鼠肾小管细胞特异性敲除DHHC9（Tub-DHHC9-/-）或APT1（Tub-APT1-/-）及对照同窝仔 UUO或IRI手术后不同时间点（如UUO后10天）取材检测纤维化指标 腺病毒介导DHHC9过表达或AAV介导β-catenin WT/C300S突变体在肾脏原位注射 药物处理：2-BP、ML348、异丙烟肼的剂量和给药方式 体外PTCs中TGFβ1处理浓度（2 ng/ml）及siRNA/质粒转染
摘要
棕榈酰化是一种可逆的翻译后修饰，由DHHC家族棕榈酰转移酶启动，并由多种酰基蛋白硫酯酶逆转。然而，蛋白质棕榈酰化在肾纤维化中的作用和机制尚未阐明。本研究表明，在小鼠模型和慢性肾脏病（CKD）患者的纤维化肾脏中，蛋白质棕榈酰化和DHHC9表达下调。在肾小管细胞中敲除DHHC9会加重肾纤维化，而通过腺病毒介导的DHHC9过表达或异丙烟肼处理诱导DHHC9表达则可保护雄性小鼠模型免受肾纤维化。机制上，DHHC9使β-catenin棕榈酰化，从而促进其泛素化和降解。此外，酰基蛋白硫酯酶1（APT1）在纤维化肾脏中被诱导，使β-catenin去棕榈酰化，增加其丰度和核转位。在雄性小鼠中，敲除肾小管细胞APT1或用ML348抑制APT1可显著保护单侧输尿管梗阻（UUO）或缺血/再灌注损伤（IRI）诱导的肾纤维化。本研究揭示了蛋白质棕榈酰化在肾纤维化中的调控机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 蛋白质棕榈酰化在肾纤维化中的作用和机制尚未阐明，本研究旨在探究DHHC9和APT1介导的β-catenin棕榈酰化在肾纤维化中的调控作用。
- 核心机制
- DHHC9催化β-catenin在Cys300位点棕榈酰化，促进其泛素化和降解；而APT1使β-catenin去棕榈酰化，增强其稳定性和核转位，从而促进纤维化。
- 主要证据
- 在PTCs中通过ABE、Click-iT、免疫共沉淀和体外PAT实验证实DHHC9和APT1对β-catenin Cys300的棕榈酰化调控；在小鼠UUO/IRI模型中，敲除或过表达DHHC9/APT1以及使用ML348或异丙烟肼处理，通过组织学染色和Western blot检测纤维化指标。
- 研究意义
- 揭示了蛋白质棕榈酰化在肾纤维化中的调控机制，提示DHHC9和APT1是CKD的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证棕榈酰化抑制对肾纤维化的影响
确定下调的蛋白质棕榈酰化是否加剧肾纤维化
给予小鼠2-BP（棕榈酰化抑制剂），进行UUO或IRI手术，通过PAS、Masson染色和纤连蛋白免疫印迹/免疫荧光评估肾损伤和纤维化。
筛选并验证DHHC9在肾纤维化中的表达和功能
明确DHHC9在肾纤维化中的表达变化及其对纤维化的作用
通过qRT-PCR、Western blot和免疫组化检测UUO/IRI小鼠及CKD患者肾组织中DHHC9表达；在PTCs中敲低或过表达DHHC9，检测FN产生；构建肾小管细胞特异性DHHC9敲除小鼠和腺病毒过表达小鼠，进行UUO/IRI手术评估纤维化。
探究DHHC9调控β-catenin的机制
验证DHHC9是否通过棕榈酰化β-catenin促进其降解
在PTCs中敲低或过表达DHHC9，检测β-catenin总蛋白、活性形式、磷酸化形式及下游Cyclin D1；利用免疫共沉淀、ABE、Click-iT和体外PAT实验验证DHHC9与β-catenin结合及棕榈酰化；通过突变体确定棕榈酰化位点Cys300；检测泛素化和降解复合物结合。
验证DHHC9通过β-catenin调控纤维化
确认DHHC9对FN产生的抑制作用依赖于β-catenin
在β-catenin敲除的PTCs中，敲低或过表达DHHC9，检测TGFβ1诱导的FN产生；使用TCF/β-catenin抑制剂ICG001处理；构建肾小管细胞特异性β-catenin敲除小鼠，进行UUO/IRI手术评估纤维化。
筛选并验证药物异丙烟肼对肾纤维化的保护作用
评估异丙烟肼通过诱导DHHC9减轻肾纤维化的效果
通过Cancer Dependency Map筛选可诱导DHHC9的药物，选择异丙烟肼；在PTCs中处理200 nM异丙烟肼，检测DHHC9和β-catenin表达及FN产生；在小鼠UUO/IRI模型中给予0.3 mg/kg/day异丙烟肼，评估纤维化。
探究APT1对β-catenin的去棕榈酰化及促纤维化作用
明确APT1是否通过去棕榈酰化β-catenin促进纤维化
在PTCs中使用ML348（APT1抑制剂）或ML349（APT2抑制剂），敲低或过表达APT1，检测β-catenin水平、棕榈酰化、泛素化及FN产生；利用C300S突变体验证位点特异性。
验证APT1在体内对肾纤维化的影响
确定抑制或敲除APT1是否减轻肾纤维化
小鼠UUO或IRI术后给予ML348注射，评估纤维化；构建肾小管细胞特异性APT1敲除小鼠（Tub-APT1-/-），进行UUO/IRI手术，检测β-catenin和纤维化指标；检测CKD患者肾组织中APT1表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 2-溴棕榈酸 | Sigma-Aldrich | 21604 |
| ML348 | MCE | HY-100736 | |
| 异丙烟肼 | MCE | HY-B0886A | |
| 细胞处理 | 转化生长因子β1 | R&D Systems | 240-B-010-CF |
| 蛋白酶体抑制 | MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 |
| 乳胞素 | Santa Cruz | sc3575 | |
| Wnt信号抑制 | ICG001 | Apexbio | A8217 |
| 体外棕榈酰化实验 | 重组人DHHC9蛋白 | abcam | ab162420 |
| 重组人β-catenin蛋白 | abcam | 63175 | |
| Western blot | 兔抗纤连蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | F3648 |
| 鼠单克隆抗微管蛋白抗体 | Santa Cruz | sc53646 | |
| 兔抗DHHC9抗体 | Sigma-Aldrich | SAB4502104 | |
| HA标签(6E2)鼠单克隆抗体 | Cell signaling technology | 2367S | |
| GAPDH多克隆抗体 | Bioworld | AP0063 | |
| β-catenin(6B3)兔单克隆抗体 | Cell signaling technology | 9582S | |
| 磷酸化β-catenin(Ser33/37)抗体 | Cell signaling technology | 2009S | |
| 非磷酸化(活性)β-catenin(Ser45)(D2U8Y)兔单克隆抗体 | Cell signaling technology | 19807S | |
| 抗Cyclin D1抗体 | Cell signaling technology | 2922S | |
| 鼠单克隆ANTI-FLAG® M2抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| Na,K-ATP酶α1(D4Y7E)兔单克隆抗体 | Cell signaling technology | 23565S | |
| 组蛋白H3(D1H2)XP®兔单克隆抗体 | Cell signaling technology | 4499S | |
| Axin1(C76H11)兔单克隆抗体 | Cell signaling technology | 2087S | |
| 酪蛋白激酶Iα抗体(H-7) | Santa Cruz Biotechnology | sc-74582 | |
| GSK-3β(27C10)兔单克隆抗体 | Cell signaling technology | 9315S | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz | sc-8017 | |
| LYPLA1(K90)多克隆抗体 | Bioworld | BS3063 | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基-F12(DMEM-F12) | Gibco | 12400024 |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | FND500 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Glibco | -- | |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| 三碘甲状腺原氨酸 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| I型胶原酶 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000试剂 | Invitrogen | -- |
| ABE assay | TCEP | Thermo Fisher Scientific | T2556 |
| N-乙基马来酰亚胺 | Thermo Fisher Scientific | 23030 | |
| 生物素-HPDP | Thermo Fisher Scientific | 21341 | |
| 链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 20357 | |
| Click-iT assay | Click-iT棕榈酸和叠氮化物 | Thermo Fisher Scientific | C10265 |
| Click-iT蛋白反应缓冲液试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10276 | |
| Click-iT fluorescence | Click-iT®细胞反应缓冲液试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10269 |
| APE assay | mPEG-马来酰亚胺 | Sigma-Aldrich | JKA3115 |
| GST pull-down | 谷胱甘肽琼脂糖珠 | Thermo Fisher Scientific | 16100 |
| 亚细胞组分分离 | 细胞组分分离试剂盒 | Cell signaling technology | 9038 |
| 免疫荧光 | DAPI | olarbio | C0065S |
| 蛋白浓缩 | 30 kDa离心柱 | Beyotime Biotechnology | FUF053-5pcs |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | 小鼠品系、周龄、性别、手术方式（UUO或IRI）及取材时间点 阅读提示：Methods部分Animals和UUO and IRI surgery小节 |
| 药物处理 | 2-BP、ML348、异丙烟肼的给药剂量、途径和持续时间 阅读提示：Results中对应段落及Figure legends（如Fig.1e, 7d, Supplementary Fig.8） |
| 细胞实验 | PTCs来源、培养条件、TGFβ1处理浓度（2 ng/ml）和时间、转染试剂和条件 阅读提示：Methods部分Cell culture and transfection小节 |
| 棕榈酰化检测 | ABE、Click-iT、APE实验的具体步骤、试剂浓度和孵育时间 阅读提示：Methods部分Acyl–biotin exchange、Click-iT identification、Acyl-PEG exchange assay小节 |
| 体内过表达/敲除验证 | 腺病毒/AAV注射量、注射部位、注射时间；Cre重组酶效率验证 阅读提示：Methods部分UUO and IRI surgery及Supplementary Figs.4,5,10 |