开发可点击亲电嘌呤探针
建立可共价标记嘌呤结合蛋白的半胱氨酸反应性化学探针。
设计含氯离去基团和炔基报告标签的嘌呤类似物AHL-Pu-1和AHL-Pu-2，通过HPLC、X射线晶体学和NMR验证其与亲核试剂的SNAr反应及产物结构。
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活细胞中RNA结合活性的化学蛋白质组学捕获
Chemoproteomic capture of RNA binding activity in living cells.
实验完整度
高包含活细胞化学蛋白质组学、4SU光交联、fPAR-CLIP、PNK assay及突变体验证等多层证据
主要模型
HEK293T细胞 DM93细胞 重组FLAG标签PTBP1/EXOC4/UIMC1表达体系
重点核对
PACCE中RS-Cys判定阈值SR>2，并以SILAC轻/重1:1混合对照比较 4SU处理条件：100 μM、16 h，312 nm UV交联1 J/cm2 原位CEP标记：AHL-Pu-1 25 μM、37 °C、1 h fPAR-CLIP使用抗FLAG M2磁珠免疫沉淀FLAG标签RNP 突变体验证：PTBP1Δ1-59、PTBP1Δ1-143、EXOC4Δ947-967
摘要
RNA相互作用组捕获（RIC）的蛋白质组学方法主要依赖将天然或标记的细胞RNA交联，以富集和研究细胞中RNA结合蛋白（RBP）的组成与功能。然而，通过RIC在单个结合位点水平测量RBP活性一直较为困难，原因是从RNA-蛋白质交联位点衍生而来的肽加合物具有异质性。在此，我们提出一种正交策略，利用可点击的亲电嘌呤，通过与4-硫尿苷（4SU）标记RNA在细胞中的光亲和竞争，直接定量蛋白质上的蛋白质-RNA相互作用。我们的光激活竞争与化学蛋白质组学富集（PACCE）方法促进了在约3000种蛋白质中检测到超过5500个半胱氨酸位点，这些位点显示出对RNA敏感的探针结合改变。重要的是，PACCE能够对经典RNA结合结构域进行功能分析，并发现人蛋白质组中的兼职RNA结合活性。总之，我们提出了一个用于全局定量活细胞中蛋白质-RNA结合活性的化学蛋白质组学平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否在活细胞中以氨基酸位点分辨率全局定量蛋白质-RNA结合活性，并发现未注释的RNA结合活性？
- 核心机制
- 4SU标记RNA经UV交联保护蛋白质-RNA界面，阻止亲电嘌呤CEP探针在RNA敏感半胱氨酸位点上的共价标记，从而通过竞争程度反映RNA结合活性。
- 主要证据
- PACCE在HEK293T和DM93细胞中检测到超过5000个RS-Cys位点，映射到约3000种蛋白质；RS-Cys位点富集于已知RBD并与结合RNA距离更近；fPAR-CLIP、PNK assay和突变体RNP形成实验验证EXOC4与UIMC1的RNA结合活性。
- 研究意义
- 提供了一种在活细胞中全局定量蛋白质-RNA结合活性的化学蛋白质组学平台，并可支持RBP的共价位点发现和药理学调控研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
在活细胞中基准评估CEP探针
确认CEP探针的非毒性、半胱氨酸选择性和蛋白质组覆盖范围。
在DM93等细胞中用CEP处理，进行CuAAC连接desthiobiotin-azide，avidin富集和LC-MS/MS鉴定探针修饰位点，并与IA/DBIA数据集比较。
建立PACCE光亲和竞争流程
通过4SU-RNA光交联竞争识别RNA敏感半胱氨酸位点。
细胞用4SU代谢标记RNA，312 nm UV交联后原位加入AHL-Pu-1标记，经点击化学富集和LC-MS/MS定量SILAC比值，筛选RS-Cys位点。
定位RS-Cys与RNA界面关系
评估RS-Cys位点是否位于或邻近蛋白质-RNA结合界面。
分析DDX19B、DDX17、DDX3X等位点的MS1 EIC和RNA敏感性，并利用PDB中RBP-RNA结构计算半胱氨酸与RNA的欧氏距离。
发现并验证兼职RNA结合蛋白
验证PACCE能否发现未注释为RBP的蛋白质具有RNA结合活性。
选择EXOC4和UIMC1作为候选，通过fPAR-CLIP检测FLAG标签RNP的荧光标记RNA，PNK assay检测32P标记RNA 5′端，并用缺失突变体评估RNP形成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证RNA结合活性
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Omega Scientific | -- |
| L-谷氨酰胺 | Fisher Scientific | -- | |
| 透析胎牛血清 | Omega Scientific | -- | |
| L-精氨酸 | -- | -- | |
| L-赖氨酸 | -- | -- | |
| [13C615N4]L-精氨酸 | -- | -- | |
| [13C615N2]L-赖氨酸 | -- | -- | |
| 细胞裂解 | cOmplete无EDTA蛋白酶抑制剂片 | Sigma-Aldrich | 11836170001 |
| 点击化学反应 | 罗丹明叠氮 | -- | -- |
| 三(2-羧乙基)膦 | -- | -- | |
| 三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺 | -- | -- | |
| 硫酸铜 | -- | -- | |
| 脱硫生物素叠氮 | -- | -- | |
| 肽段纯化 | mini Bio-Spin色谱柱 | Bio-Rad | 7326207 |
| 蛋白定量 | Bio-Rad DC蛋白定量 assay | Bio-Rad | -- |
| 核酸酶处理 | RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 |
| DNase 1 | NEB | M0303L | |
| 蛋白酶K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| RNase保护 | 重组RNasin | Promega | N2511 |
| RNA纯化 | PureLink RNA Mini Kit | Thermo Fisher | 12183018 A |
| 质粒构建 | pcDNA3.1-UIMC1-FLAG | GenScript | -- |
| pcDNA3.1-EXOC4-FLAG | GenScript | -- | |
| fPAR-CLIP | 抗FLAG M2磁珠 | MilliporeSigma | M8823 |
| RNase I | Thermo Fischer Scientific | AM2294 | |
| SUPERase•In | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| Quick CIP | NEB | M0525S | |
| T4 Rnl2(1–249)K227Q连接酶 | NEB | M0351 | |
| NuPAGE LDS样品缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris中型蛋白凝胶 | Thermo Fischer Scientific | WG1401BOX | |
| PageRuler Plus预染蛋白分子量标准 | Thermo Fisher Scientific | 26620 | |
| Western blot | 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F7425-2MG |
| 山羊抗GAPDH IgG | Cell signaling Technology | 2118 S | |
| PNK assay | [γ-32P] rATP | -- | -- |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | -- | |
| 细胞活力检测 | WST-1 assay | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PACCE活细胞标记与交联 | 4SU浓度与时间（100 μM、16 h）、UV波长与剂量（312 nm、1 J/cm2）、AHL-Pu-1浓度与标记时间（25 μM、1 h） 阅读提示：Methods中“PACCE in situ workflow for identification of RBPs”及Supplementary Fig. 10 |
| RS-Cys判定 | SILAC轻/重标记、1:1混合对照、SR>2阈值及统计检验 阅读提示：Methods中“LC-MS/MS data analysis of CEP-modified peptides”与Supplementary Fig. 16 |
| 4SU掺入条件优化 | 4SU浓度100与500 μM、处理1–24 h、RNA dot blot与细胞活力评估 阅读提示：Methods中“Identifying non-toxic conditions for 4SU metabolic incorporation into cellular RNA” |
| CEP探针处理与半胱氨酸选择性 | DM93细胞中CEP 25 μM、4 h；探针修饰位点半胱氨酸比例及IA/DBIA对照 阅读提示：Methods中“Reactivity of CEP probes in situ”及Results相关段落 |
| 候选RBP验证 | FLAG-PTBP1/EXOC4/UIMC1转染时间、4SU标记条件、fPAR-CLIP和PNK assay的RNase处理与免疫沉淀条件 阅读提示：Methods中“Transient transfection of recombinant proteins”“Fluorescence-based PAR-CLIP”“Polynucleotide kinase assay”及Fig. 5 |