P110的酶动力学表征
确定P110对Drp1 GTPase的抑制类型
使用重组Drp1和cP110，通过GTPase assay测定Km和Vmax；使用BODIPY-TMR标记的P110进行荧光偏振实验，在GMPPCP、GTP、GDP存在下测定Kd。
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靶向动力相关蛋白1的变构位点抑制Fis1介导的线粒体功能障碍
Targeting an allosteric site in dynamin-related protein 1 to inhibit Fis1-mediated mitochondrial dysfunction.
实验完整度
高包含体外GTP酶动力学、细胞模型、小鼠内毒素血症模型及机制验证（PLA、突变体）
主要模型
H9c2大鼠心肌细胞 HEK293人胚胎肾细胞 RAW 264.7小鼠巨噬细胞 LPS诱导的内毒素血症小鼠模型
重点核对
SC9在体外抑制Drp1 GTPase的IC50为270 nM ± 60 nM SC9在H9c2细胞中抑制LPS诱导的线粒体去极化的EC50为750 nM ± 290 nM SC9（10 mg/kg，腹腔注射，0 h和4 h两次）提高LPS（0.3 mg）处理小鼠的生存率（从20%到67%） SC9（10 µM）竞争性抑制BODIPY-TMR-cP110与Drp1的结合 SC9在D49A/R53A双突变Drp1中抑制活性显著降低
摘要
大型胞质GTP酶动力相关蛋白1（Drp1）介导生理性和病理性线粒体分裂。细胞应激触发Drp1与线粒体Fis1结合，随后导致线粒体片段化、ROS产生、代谢崩溃和细胞死亡。由于Drp1也通过结合线粒体Mff介导生理性分裂，抑制病理性分裂的疗法应保留生理性线粒体分裂。P110是一种Drp1-Fis1相互作用的肽抑制剂，在多种神经退行性疾病、缺血和脓毒症模型中减少病理损伤，而不阻断Drp1的生理功能。由于肽类具有药代动力学局限性，我们着手鉴定模拟P110益处的小分子。我们将P110结合位点定位到Drp1上switch I邻近的沟槽（SWAG）。筛选结合SWAG的小分子鉴定出SC9，其在细胞和小鼠内毒素血症模型中模拟P110的益处。我们提示，本研究发现SWAG结合小分子可能减轻Drp1介导的病理负担，并可能减轻与GTP酶家族其他成员相关的病理。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否发现模拟P110益处的小分子，并阐明P110的作用机制和结合位点？
- 核心机制
- P110和SC9结合Drp1的SWAG变构位点，选择性抑制Drp1-Fis1相互作用，而不影响Drp1-Mff介导的生理性分裂。
- 主要证据
- GTP酶动力学、荧光偏振、竞争性结合实验、D49A/R53A突变体、细胞线粒体形态和功能检测、PLA、小鼠内毒素血症模型。
- 研究意义
- SWAG结合小分子可能减轻Drp1介导的病理负担，并可能推广至GTP酶家族其他成员。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SWAG位点的结构鉴定
定位P110在Drp1上的结合位点
基于晶体结构（PDB: 3W6P, 4BEJ, 3W6O）分析构象变化；使用MOE Site Finder和ESSA分析可成药性。
虚拟筛选SWAG结合小分子
从化合物库中筛选可能结合SWAG的小分子
使用8特征药效团模型筛选CoCoCo库（690万化合物），要求满足至少7个特征，并用SwissADME过滤。
候选化合物生化验证
验证SC1、SC3、SC9是否模拟P110的生化活性
测定化合物对野生型、D49A和D49A/R53A Drp1 GTPase的抑制；竞争性结合实验；测定对Dnm2 GTPase的抑制。
细胞水平验证
验证SC9是否模拟P110在细胞中抑制LPS诱导的线粒体功能障碍
在H9c2细胞中LPS处理并给予化合物，检测线粒体形态（MitoTracker）、膜电位（TMRM）、ROS（MitoSOX）；在HEK293、RAW264.7和MEF中检测ROS。
机制验证：Drp1-Fis1相互作用
验证SC9是否抑制Drp1-Fis1相互作用而不影响Drp1-Mff
免疫染色检测线粒体Drp1聚焦点；Western blot检测总Drp1；PLA检测Drp1-Fis1和Drp1-Mff相互作用。
体内药效验证
验证SC9在小鼠内毒素血症模型中的疗效
在LPS诱导的内毒素血症小鼠中给予SC9，监测生存率、体重、脓毒症评分、呼吸窘迫评分和炎症因子。
药代动力学和安全性评估
评估SC9的药代动力学和毒性
单次腹腔注射SC9后测定血浆和脑组织浓度；在C57Bl6/J小鼠中给予50 mg/kg SC9，观察3天，检测血清学生化指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 肽合成 | 环状P110肽 | CPC Scientific | -- |
| BODIPY-TMR标记环状P110肽 | CPC Scientific | -- | |
| 线性BODIPY-TMR-AGGDLLPRGS肽 | AnaSpec | -- | |
| TAT47-57偶联P110肽 | Ontores | -- | |
| 化合物处理 | SC1化合物 | Mcule | -- |
| SC3化合物 | Mcule | -- | |
| SC9化合物 | Mcule | -- | |
| Mdivi-1 | Sigma | M0199 | |
| LPS处理 | 脂多糖 | Sigma | L4391 |
| 重组蛋白表达 | pET-28a载体 | EMD Millipore | 698643 |
| Gibson克隆试剂盒 | NEB | E2611S | |
| 重组蛋白纯化 | BugBuster主混合物 | Sigma | P8849 |
| 镍His重力柱 | Cytiva | 11-0033-99 | |
| Zeba离心脱盐柱，7K MWCO，10 mL | Thermo Fisher | 89894 | |
| 定点突变 | Agilent Quick Change II定点突变试剂盒 | Agilent | 200523 |
| GTPase活性测定 | Sigma孔雀石绿磷酸盐测定试剂盒 | Sigma | MAK307 |
| GTP | Thermo Scientific | R0461 | |
| 透明96孔测定板 | Corning | 3795 | |
| 荧光偏振实验 | GMPPCP | Sigma | M3509 |
| GDP | Abcam | ab146529 | |
| 黑色384孔小体积微孔板 | Greiner | 784076 | |
| Tecan Infinite M1000酶标仪 | Tecan | 14381 | |
| 竞争性结合实验 | 牛γ-球蛋白 | Sigma | G5009 |
| 细胞培养与处理 | H9c2(2-1)细胞 | ATCC | CRL-1446 |
| RAW 264.7细胞 | ATCC | TIB-71 | |
| HEK-293细胞 | ATCC | CRL-1573 | |
| 线粒体膜电位和ROS测定 | Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 |
| 四甲基罗丹明 | Thermo Fisher | T668 | |
| MitoTracker深红FM | ThermoFisher | M22426 | |
| MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂 | Invitrogen | M36008 | |
| 细胞培养与处理 | 过氧化氢 | Sigma | 216763 |
| 免疫染色 | 小鼠抗Drp1抗体 | BD Biosciences | 611113 |
| 兔抗Fis1抗体 | Proteintech | 10956-1-AP | |
| 山羊抗兔IgG (H+L) DyLight 488 | Invitrogen | 35552 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L) DyLight 650 | Invitrogen | 84545 | |
| 含DAPI封片剂 | Sigma | DUO82040 | |
| 邻位连接实验 | Duolink红色试剂盒 | Sigma | DUO92103 |
| 兔抗MFF抗体 | Proteintech | 17090-1-AP | |
| Western blot | Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 |
| 抗Drp1兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 5391 | |
| 抗α-微管蛋白小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3873 | |
| 抗小鼠IgG | GE Healthcare | NA931V | |
| 抗兔IgG | GE Healthcare | NA934V | |
| 兔抗Drp1单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 8570 | |
| 小鼠抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GTPase活性测定 | Drp1浓度100 nM，cP110或化合物浓度1 µM，GTP浓度范围，反应时间30-60分钟，温度37°C 阅读提示：Methods: GTPase assay |
| 细胞线粒体形态与功能检测 | H9c2细胞密度，LPS浓度2 µg/ml，化合物浓度2 µM，处理时间16小时（形态）或24小时（膜电位），TMRM 100 nM，MitoSOX 5 µM 阅读提示：Methods: Mitochondrial membrane potential and mitochondrial ROS production using TMRM and MitoSOX 96-well plate assay; Live-cell mitochondrial microscopy |
| Drp1-Fis1相互作用检测 | LPS 2 µg/ml，化合物2 µM，PLA抗体浓度（抗Drp1 1:50，抗Fis1 1:66，抗Mff 1:66），处理时间23+1小时 阅读提示：Methods: Immunostaining and imaging of Drp1 foci and proximity ligation assay |
| 小鼠内毒素血症模型 | 小鼠品系（雌性BALB/c），周龄（7周），LPS剂量（0.2-0.325 mg/只），SC9剂量（10 mg/kg），给药途径（腹腔注射），给药时间（0 h和4 h），监测指标（生存率、体重、MSS、呼吸窘迫评分） 阅读提示：Methods: Mouse LPS-induced endotoxemia study |
| 药代动力学分析 | SC9剂量20 mg/kg，给药途径腹腔注射，采样时间点（15分钟、4小时、16小时），检测基质（血浆、脑组织） 阅读提示：Methods: SC9 pharmacokinetics |