建立ER+乳腺癌骨转移PDX模型
获得可进行转录组和代谢组分析的转移性ER+乳腺癌临床前模型。
将ER+乳腺癌患者骨转移活检组织植入Swiss nude小鼠肩胛间脂肪垫，建立PDX模型。
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氧化磷酸化是内分泌治疗和palbociclib耐药转移性乳腺癌的代谢脆弱性
Oxidative phosphorylation is a metabolic vulnerability of endocrine therapy and palbociclib resistant metastatic breast cancers.
实验完整度
高包含PDX模型、同源细胞系、患者肿瘤队列、代谢组学和基因组分析，并有功能验证和机制验证
主要模型
ER+乳腺癌骨转移来源PDX模型 内分泌治疗和palbociclib耐药同源细胞系 503例乳腺癌患者肿瘤队列
重点核对
PDX模型对IACS-010759的体内反应（肿瘤体积变化） 细胞系对IACS-010759的IC50和OXPHOS依赖性（OCR/ECAR比值） PIK3CA/AKT1突变与IACS-010759反应的关联 IACS-010759处理后代谢物水平变化（谷胱甘肽、糖原、戊糖磷酸途径） OXPHOS相关基因表达与患者无转移生存的关联
摘要
对于大多数雌激素受体阳性乳腺癌（ER+ BC）患者，内分泌治疗和CDK4/6抑制剂耐药几乎不可避免。通过对患者肿瘤、转移灶来源的患者来源异种移植（PDX）和同源细胞系的基因组和代谢组学分析，我们证明一部分转移性ER+ BC高度依赖氧化磷酸化（OXPHOS）。OXPHOS抑制剂IACS-010759治疗可强烈抑制多个内分泌和palbociclib耐药PDX的肿瘤生长。PIK3CA/AKT1基因突变与IACS-010759反应显著相关。在代谢水平上，体内对IACS-010759的反应与治疗肿瘤中谷胱甘肽、糖原和戊糖磷酸途径代谢物水平降低相关。体外，内分泌和palbociclib耐药细胞显示OXPHOS依赖性增加，IACS-010759处理后ROS水平增加。最后，在ER+ BC患者中，OXPHOS相关基因高表达预测预后不良。总之，这些结果确定OXPHOS是治疗耐药ER+ BC患者的有希望靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 内分泌治疗和palbociclib耐药的转移性ER+乳腺癌是否依赖OXPHOS，以及靶向OXPHOS能否作为治疗策略。
- 核心机制
- 部分转移性ER+乳腺癌依赖OXPHOS，抑制OXPHOS可降低肿瘤生长并影响谷胱甘肽、糖原和戊糖磷酸途径代谢，PIK3CA/AKT1突变和MYC扩增可能与反应相关。
- 主要证据
- 通过PDX模型、同源耐药细胞系和患者肿瘤队列的基因组、代谢组学及功能实验，发现IACS-010759抑制多个耐药PDX肿瘤生长，耐药细胞OXPHOS依赖性增加，OXPHOS基因高表达与不良预后相关。
- 研究意义
- 这些结果确定OXPHOS是治疗耐药ER+ BC患者的有希望靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较PDX与患者原发肿瘤的转录组和代谢组
鉴定转移灶来源样本中富集的代谢通路。
对BM PDX和患者原发肿瘤进行GSEA和全局代谢组学分析（UPLC-MS/MS）。
评估OXPHOS抑制剂IACS-010759在PDX中的体内抗肿瘤活性
验证靶向OXPHOS能否抑制ER+乳腺癌骨转移PDX肿瘤生长。
对7个ER+ BM PDX给予IACS-010759，监测肿瘤体积变化；部分模型比较不同剂量及与metformin的效应。
建立palbociclib耐药PDX模型并评估IACS-010759疗效
验证OXPHOS靶向在palbociclib耐药肿瘤中的效果。
建立HBCx-124 palboR25和HBCx-134 palboR31 PDX，进行GSEA分析，并给予IACS-010759单药或联合palbociclib+fulvestrant治疗。
评估耐药细胞系对IACS-010759的敏感性和OXPHOS依赖性
在体外验证内分泌和palbociclib耐药细胞的OXPHOS依赖性和对IACS-010759的敏感性。
对MCF7 LTED、T47D LTED、MCF7-PalboR及其亲本细胞进行IACS-010759剂量反应和Seahorse Mito Stress Test。
分析IACS-010759反应的代谢组学变化
鉴定与IACS-010759反应或耐药相关的代谢改变。
对IACS反应者HBCx-124和耐药者HBCx-137的对照和IACS治疗肿瘤进行全局代谢组学分析。
评估谷胱甘肽合成抑制对IACS-010759敏感性的影响
验证谷胱甘肽代谢在IACS-010759反应中的作用。
在HBCx-137来源3D细胞培养中联合BSO和IACS-010759，检测细胞活力。
检测IACS-010759对耐药细胞ROS水平的影响
验证OXPHOS抑制是否导致耐药细胞氧化还原失衡。
MCF7-LTED和PalboR细胞用IACS-010759处理72小时，用CellROX和DCFDA染色检测ROS。
分析OXPHOS相关基因在乳腺癌患者队列中的预后意义
评估OXPHOS相关基因表达与乳腺癌患者预后的关联。
在503例乳腺癌患者肿瘤样本中通过RT-PCR检测AIFM1、NDUFV1、NDU FAB1、NDUFA7、NDUFS6和MRPS12表达，分析无转移生存。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 体内药物治疗 | IACS-010759 | MedchemExpress | -- |
| palbociclib | MedchemExpress | -- | |
| 氟维司群（Faslodex） | AstraZeneca | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Euroclone | -- | |
| 17β-雌二醇 | Sigma | -- | |
| 葡聚糖活性炭剥离胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| palbociclib | Pfizer | -- | |
| 细胞活力检测 | 结晶紫 | Sigma | 548-62-9 |
| 3D细胞培养 | 胰蛋白酶 | GIBCO | -- |
| Dispase酶 | StemCell Technologies | 7913 | |
| DNase | Sigma | D4513 | |
| MEGM培养基 | Lonza | CC-3150 | |
| 丁硫氨酸亚砜亚胺（BSO） | Sigma | B2515 | |
| 细胞活力检测 | CellTiterGlo检测 | Promega | G7571 |
| Seahorse分析 | Seahorse细胞外流量分析仪XFe96 | Agilent | -- |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| ROS检测 | CellROX | Thermo Fisher Scientific | C10444 |
| DCFDA（2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯） | MERCK | D6883 | |
| RNA提取 | miRNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 217004 |
| 无RNase的DNase | Qiagen | 79254 | |
| RNA测序 | Illumina TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| KAPA文库定量试剂盒 | Roche | -- | |
| RT-PCR | Power SYBR® Green Master Mix | Perkin-Elmer Applied Biosystems | 4368708 |
| Superscript II RNase H-逆转录酶 | Gibco-BRL | 18064014 | |
| RNasinTM核糖核酸酶抑制剂 | Promega | N2511 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PDX体内疗效实验 | IACS-010759剂量（10 mg/kg）、给药方式（口服，每周5天）、肿瘤体积范围（100-200 mm³） 阅读提示：Methods中In vivo efficacy studies小节 |
| palbociclib耐药PDX模型 | 耐药模型建立方法、治疗持续时间（50天）、随访时间（6个月） 阅读提示：Results中Oxidative phosphorylation is a metabolic vulnerability in PDX models...小节及Fig. 2F |
| 细胞系IACS-010759敏感性检测 | IACS-010759浓度范围（10^-11至10^-4 M）、处理时间（72小时）、重复数（n=3独立实验） 阅读提示：Methods中Cell viability assay小节及Fig. 3A图注 |
| Seahorse OXPHOS依赖性检测 | 细胞接种密度（1.5-2×10^4细胞/孔）、oligomycin浓度（1 μM）、技术重复数（8-10） 阅读提示：Methods中Seahorse-based oxidative phenotyping小节 |
| 代谢组学分析 | HBCx-124和HBCx-137每组小鼠数量（n=5和n=6）、IACS-010759处理时间 阅读提示：Fig. 5A图注及Methods中Global metabolomics analysis小节 |
| 患者队列预后分析 | 患者数量（503）、随访时间（中位9年）、基因表达检测方法（RT-PCR）、内参（TBP） 阅读提示：Methods中Institut Curie clinical cohort和RNA extraction, cDNA synthesis and PCR amplification小节 |