高通量药物筛选鉴定协同组合
筛选与pevonedistat协同杀伤结直肠癌细胞的药物。
在HCT116细胞中用MIPE 5.0文库（2480种药物）进行高通量筛选，并用6×6矩阵筛选测试PEV与文库中药物的组合，以ExcessHSA评分协同作用。
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靶向neddylation通过失活DCAF13-CRL4泛素连接酶复合物使结直肠癌对拓扑异构酶I抑制剂敏感
Targeting neddylation sensitizes colorectal cancer to topoisomerase I inhibitors by inactivating the DCAF13-CRL4 ubiquitin ligase complex.
实验完整度
高包含细胞系、患者来源类器官和异种移植模型等多层级证据，并进行功能与机制验证
主要模型
HCT116结直肠癌细胞系 患者来源结直肠癌类器官（PDOs #1、#2、#3） HCT116细胞皮下异种移植瘤裸鼠模型
重点核对
PEV（10 μM）预处理SN38处理细胞，ICE assay检测TOP1-DPC清除延迟 CRL4A/B过表达或敲低后DUST assay检测TOP1-DPC泛素化水平 CUL4A K705R和CUL4B K859R突变体对TOP1-DPC泛素化的影响 DCAF13敲低或WD40结构域缺失突变对TOP1-DPC泛素化的影响 异种移植瘤模型中PEV（2.5或15 mg/kg）联合伊立替康（20 mg/kg）的肿瘤生长和生存期
摘要
结直肠癌（CRC）在全球范围内普遍存在，但当前的治疗方法仍不充分。通过化学遗传学筛选，我们发现同时抑制拓扑异构酶I（TOP1）和NEDD8在人类CRC细胞中具有协同细胞毒性。拓扑异构酶I抑制剂伊立替康或其生物活性代谢物SN38与NEDD8激活酶抑制剂pevonedistat联合在CRC患者来源的类器官和异种移植模型中表现出协同作用。机制上，我们证明pevonedistat阻断了TOP1抑制剂诱导的TOP1 DNA-蛋白质交联（TOP1-DPCs）的泛素/蛋白酶体依赖性修复，并且CUL4-RBX1复合物（CRL4）是在复制过程中通过自身NEDD8修饰后作用于TOP1-DPCs进行蛋白酶体降解的主要泛素连接酶。我们鉴定DCAF13，一种DDB1和Cullin相关因子，作为CRL4识别TOP1-DPCs的受体。我们的研究不仅揭示了一条修复TOP1-DPCs的复制偶联泛素-蛋白酶体通路，还为联合TOP1抑制剂和pevonedistat治疗CRC及其他类型癌症提供了分子和转化依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NEDD8化是否以及如何调控TOP1-DNA蛋白交联（TOP1-DPC）的修复，从而影响结直肠癌对拓扑异构酶I抑制剂的敏感性。
- 核心机制
- NEDD8化激活CRL4（CUL4-RBX1）泛素连接酶，DCAF13作为底物受体通过其WD40重复序列结合TOP1核心结构域，介导TOP1-DPC的K48连接多泛素化及蛋白酶体降解；pevonedistat抑制NEDD8化从而阻断该修复通路。
- 主要证据
- 在HCT116细胞、患者来源类器官和异种移植瘤中，PEV与SN38/伊立替康联用表现出协同细胞毒性和肿瘤生长抑制；ICE、DUST、单分子成像、PLA和iPOND等实验证明NEDD8化通过CRL4-DCAF13促进TOP1-DPC泛素化与降解，且该过程依赖DNA复制。
- 研究意义
- 揭示了复制偶联的泛素-蛋白酶体通路修复TOP1-DPC的机制，为联合TOP1抑制剂和pevonedistat治疗结直肠癌及其他癌症提供了分子和转化依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞系中验证PEV与TOP1抑制剂协同作用
验证PEV与SN38在多种结直肠癌细胞系中的协同细胞毒性和凋亡诱导作用。
用ATPlite发光法检测PEV与SN38联合处理7种CRC细胞系的细胞活力，并用Western blot和ELISA检测cleaved caspase-3。
患者来源类器官和异种移植模型中验证联合效果
在更接近临床的模型中验证PEV与伊立替康/SN38联合的抗肿瘤效果。
用3个mCRC患者来源类器官（PDOs #1、#2、#3）进行CellTiter-Glo 3D活力检测；用HCT116异种移植瘤裸鼠模型评估PEV联合伊立替康或拓扑替康的肿瘤生长和生存期。
检测NEDD8化对TOP1-DPC修复的影响
验证PEV是否通过抑制TOP1-DPC清除来增敏TOP1抑制剂。
用ICE assay检测SN38诱导的TOP1-DPC在PEV预处理后的清除情况；用单分子荧光显微镜追踪TOP1-HaloTag动态；用中性彗星实验检测seDSB；用Western blot检测DDR标志物。
鉴定CRL4为TOP1-DPC的泛素连接酶
确定哪个cullin家族成员参与TOP1-DPC的泛素化，并验证CRL4的作用。
在RBX1过表达的HCT116细胞中转染各种Myc-cullin，用DUST assay检测TOP1-DPC泛素化；用体外泛素化实验验证CUL4A-RBX1对TOP1-DPC的泛素化；用siRNA或CRISPR敲低/敲除CUL4A/B。
验证CRL4的NEDD8化修饰及其对TOP1-DPC泛素化的调控
确定CRL4是否通过NEDD8化激活并介导TOP1-DPC泛素化。
用IP检测CUL4A/B的NEDD8化；用K705R/K859R突变体阻断NEDD8化；用DUST assay检测突变体对TOP1-DPC泛素化的影响。
验证CRL4介导的TOP1-DPC泛素化依赖DNA复制
确定CRL4对TOP1-DPC的泛素化是否与DNA复制偶联。
用复制抑制剂APH或转录抑制剂THZ1预处理，然后进行DUST assay；用Ub K48或K63突变体确定泛素链类型；用ICE assay检测CRL4对TOP1-DPC清除的影响。
鉴定DCAF13为CRL4识别TOP1-DPC的受体
确定哪个DCAF蛋白介导CRL4对TOP1-DPC的识别。
用His-TOP1 pull-down结合LC-MS/MS鉴定与TOP1结合的DCAF蛋白；用siRNA敲低DDB2、DCAF7或DCAF13，DUST assay检测TOP1-DPC泛素化；用免疫荧光、PLA和iPOND验证DCAF13与TOP1-DPC在复制染色质上的相互作用。
确定DCAF13与TOP1相互作用的区域
确定DCAF13的WD40结构域和TOP1的核心结构域在相互作用中的作用。
用His-TOP1截短体pull-down确定与DCAF13结合的TOP1结构域；用DCAF13 WD40缺失突变体进行FLAG-IP和DUST assay；用AlphaFold2建模DCAF13 WD40结构。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因编辑与敲低
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 高通量筛选 | pevonedistat | TargetMol | T6332 |
| CellTiter-Glo | Promega | -- | |
| 细胞活力检测 | ATPlite一步法试剂盒 | PerkinElmer | -- |
| CellTiter-Glo发光细胞活力检测 | Promega | -- | |
| 类器官培养 | 基质胶 | Corning | -- |
| 基底膜提取物 | Corning | -- | |
| 分散酶 | StemCell Technologies | -- | |
| RNA-seq | NEBNext Poly(A)磁力模块 | New England Biolabs | E7490 |
| NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7760S | |
| Western blot | 抗α微管蛋白大鼠多克隆抗体 | Santa Cruz | sc-53030 |
| 抗泛素小鼠单克隆抗体 | Santa Cruz | sc-8017 | |
| 抗磷酸化组蛋白H2A.X（Ser139）小鼠单克隆抗体 | Millipore | 05-636-I | |
| 抗pRPA32（Ser4/Ser8）兔多克隆抗体 | Bethyl Lab | A300-245A | |
| 抗pCHK1（Ser345）兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 2348 | |
| 抗TOP1小鼠单克隆抗体 | BD Biosciences | 556597 | |
| 抗TOP1-DPC小鼠单克隆抗体 | Millipore | MABE1084 | |
| 抗His标签兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 12698 | |
| 抗FLAG小鼠单克隆抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗FLAG兔多克隆抗体 | Sigma | F7425 | |
| 抗Myc小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling | 2276 | |
| 抗双链DNA小鼠单克隆抗体 | Abcam | ab27156 | |
| 抗CUL4A兔多克隆抗体 | Bethyl Lab | A300-739A | |
| 抗CUL4B兔多克隆抗体 | Novus Biological | H00008450-B01P | |
| 抗DDB2兔多克隆抗体 | Thermo Fisher | PA5-37361 | |
| 抗DCAF7兔多克隆抗体 | Thermo Fisher | PA5-93222 | |
| 抗DCAF13兔单克隆抗体 | Abcam | ab195121 | |
| 抗p53兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9282 | |
| 抗cleaved caspase-3兔多克隆抗体 | Abcam | ab2302 | |
| siRNA转染 | 对照siRNA | Dharmacon | D-001206-13-05 |
| CUL4A siRNA | Dharmacon | M-012610-01-0005 | |
| CUL4B siRNA | Dharmacon | M-017965-01-0005 | |
| DDB2 siRNA | Dharmacon | M-011022-01-0005 | |
| DCAF7 siRNA | Dharmacon | M-019999-01-0005 | |
| DCAF13 siRNA | Dharmacon | M-017898-01-0005 | |
| p53 siRNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-29435 | |
| 质粒转染 | DCAF13-FLAG | OriGene | RC211029 |
| RBX1-FLAG | OriGene | RC200348 | |
| 邻近连接实验 | Duolink PLA荧光实验 | Sigma-Aldrich | DUO92101 |
| 中性彗星实验 | 彗星实验试剂盒 | R&D Systems | 4250-050-K |
| iPOND | 生物素叠氮化物 | Thermo Fisher | B10184 |
| 体外泛素化 | 重组人泛素 | R&D Systems | U-100H |
| 重组人泛素激活酶E1 | R&D systems | E-305 | |
| 重组人UbcH5a | R&D systems | E2-616 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Life Technologies | -- |
| RPMI1640培养基 | -- | -- | |
| 动物实验 | 基质胶 | -- | -- |
| D-荧光素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力与联合指数分析 | PEV预处理时间（4小时）、SN38处理时间（72小时）、细胞系种类和代数（25代以内）、检测方法（ATPlite或CellTiter-Glo） 阅读提示：Methods中Cell viability assay小节及Figure 1e图注 |
| ICE assay检测TOP1-DPC | PEV浓度（10 μM）和处理时间（1小时）、SN38浓度（500 nM或10 μM）和时间、DNA上样量（2 μg）、离心条件 阅读提示：Methods中In vivo of complex (ICE) assay小节及Figure 3b图注 |
| DUST assay检测TOP1-DPC泛素化 | CPT浓度（20 μM）和处理时间（30分钟）、DNA上样量（10 μg）、微球菌核酸酶用量（50 units）、抗体验证 阅读提示：Methods中DUST assay小节及Figure 4a图注 |
| 类器官药物处理 | PDO来源（mCRC患者肝转移灶）、接种密度（2000细胞/孔）、药物处理时间（72小时）、活力检测试剂（CellTiter-Glo） 阅读提示：Methods中Patient-derived organoid (PDO) culture and maintenance及Drug treatment in PDOs小节，Figure 2a图注 |
| 异种移植瘤实验 | 细胞接种量（0.75 Mio cells/mouse）、小鼠品系和性别（雌性无胸腺裸鼠，6-8周龄）、肿瘤起始大小（95.7 mm3）、PEV剂量（2.5或15 mg/kg）和给药方案、伊立替康剂量（20 mg/kg）和给药方案、每组动物数 阅读提示：Methods中Luciferase expressing HCT116 cell line-derived mouse xenografts小节及Figure 2c图注 |
| 单分子荧光显微镜 | TOP1-HaloTag标记方法、SN38处理时间（2小时）、PEV浓度（10 μM）和预处理时间、成像缓冲液和温度 阅读提示：Methods中Single-molecule fluorescence microscopy小节及Figure 3c图注 |
| 体外泛素化实验 | TOP1-DPC浓度（100 nM）、泛素浓度（10 μM）、E1浓度（50 nM）、UbcH5a浓度（0.1 μM）、CUL4A-RBX1浓度、反应时间（30分钟）和温度（37°C） 阅读提示：Methods中Generation of TOP1cc for its in vitro ubiquitylation小节及Figure 4b图注 |