减毒病毒构建与体外验证
构建携带Nsp1-K164A/H165A等减毒修饰的SARS-CoV-2，并验证其体外减毒特性。
在WA1/2020基因组基础上删除furin切割位点PRRA、删除ORF6-8并引入Nsp1 K164A/H165A突变，获得Nsp1-K164A/H165A；另构建携带BA.1或BA.5刺突的BA.1-LAV和BA.5-LAV。
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减毒SARS-CoV-2经鼻内或空气传播介导的递送保护叙利亚仓鼠免受新变异株感染
Intranasal or airborne transmission-mediated delivery of an attenuated SARS-CoV-2 protects Syrian hamsters against new variants.
实验完整度
高多层级证据：叙利亚仓鼠鼻内免疫/空气传播模型、病毒攻击、小鼠加强免疫及体外假病毒感染
主要模型
雄性叙利亚仓鼠（Mesocricetus auratus） 雄性BALB/c小鼠 Vero E6细胞 H1299-hACE2细胞
重点核对
叙利亚仓鼠鼻内接种100 PFU或10^4 PFU Nsp1-K164A/H165A 攻击用104 PFU Delta或Omicron BA.1、BA.2.12.1、BA.5分离株 空气传播模型：供体与哨兵仓鼠用带孔金属隔板分隔，避免直接接触 BALB/c小鼠先接种两剂MVA-S，8周后鼻内给予10^4 PFU BA.1-LAV或BA.5-LAV ELISA检测RBD特异性IgG/IgA，FRNT50检测中和抗体
摘要
在评估针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等呼吸道病毒的疫苗黏膜保护作用时，检测气道中的分泌型抗体非常必要。我们发现，经鼻内递送减毒SARS-CoV-2（Nsp1-K164A/H165A）可在雄性叙利亚仓鼠中诱导黏膜和全身性IgA和IgG。有趣的是，无论是直接鼻内免疫还是通过空气传播介导的Nsp1-K164A/H165A递送，在叙利亚仓鼠中均能提供针对包括Delta、Omicron BA.1、BA.2.12.1和BA.5在内的关注变异株（VOCs）的异源攻击保护。免疫动物显示组织病毒载量和肺部炎症均显著降低。类似地，携带BA.1和BA.5刺突的减毒病毒可在先接种表达全长WA1/2020刺突蛋白的改良痘苗病毒安卡拉载体（MVA）的雄性小鼠中增强变异株特异性中和抗体。总之，这些结果表明我们的减毒病毒可能是一种有前景的鼻内疫苗候选者，用于增强针对未来SARS-CoV-2 VOCs的黏膜免疫。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 减毒SARS-CoV-2（Nsp1-K164A/H165A）经鼻内或空气传播递送能否诱导黏膜免疫并保护叙利亚仓鼠免受新变异株攻击？
- 核心机制
- 鼻内递送减毒病毒诱导黏膜和全身性IgA/IgG以及针对核衣壳蛋白的细胞免疫，可能通过细胞免疫等机制对异源变异株提供交叉保护。
- 主要证据
- 叙利亚仓鼠鼻内免疫后，血清和鼻洗液中IgA/IgG升高；对Delta、BA.1、BA.2.12.1、BA.5攻击后组织病毒载量和肺部炎症显著降低；空气传播的哨兵仓鼠也获得保护；BA.1-LAV和BA.5-LAV在MVA-S预免疫小鼠中增强变异株特异性中和抗体。
- 研究意义
- 减毒病毒Nsp1-K164A/H165A可能被进一步开发为鼻内疫苗，用于基础免疫或加强免疫，以增强针对未来SARS-CoV-2 VOCs的黏膜免疫。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鼻内免疫诱导黏膜和全身免疫应答
评估Nsp1-K164A/H165A经鼻内接种后的黏膜和全身免疫原性。
叙利亚仓鼠鼻内接种100 PFU或10^4 PFU Nsp1-K164A/H165A或WA1/2020，收集血清、鼻洗液和BALF，检测抗RBD IgG/IgA、中和抗体及IFNγ分泌细胞。
异源变异株攻击保护实验
评估鼻内免疫对Delta和Omicron变异株攻击的保护效果。
免疫后35天，用104 PFU Delta或Omicron BA.1分离株鼻内攻击，检测鼻洗液、肺、气管和鼻甲中的病毒载量及肺部病理。
空气传播介导的免疫与保护
评估Nsp1-K164A/H165A的空气传播效率及传播后对哨兵仓鼠的免疫保护。
供体仓鼠鼻内接种100 PFU Nsp1-K164A/H165A或WA1/2020，1天后与哨兵仓鼠配对于带隔板笼中，监测哨兵仓鼠感染、血清转化，并在4.5个月后用BA.2.12.1攻击。
BA.5攻击保护实验
评估Nsp1-K164A/H165A对引起较重疾病的BA.5变异株的攻击保护。
叙利亚仓鼠接种100 PFU Nsp1-K164A/H165A，60天后用104 PFU BA.5分离株鼻内攻击，检测体重、病毒载量和肺部病理。
变异株特异性加强免疫实验
评估携带BA.1或BA.5刺突的减毒病毒作为加强免疫的潜力。
BALB/c小鼠先接种两剂MVA-S，8周后鼻内给予10^4 PFU BA.1-LAV或BA.5-LAV，检测变异株特异性中和抗体。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco极限必需培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| pLVX-hACE2载体 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 病毒滴定 | 黄蓍胶 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 兔抗Wuhan-1核衣壳蛋白抗体 | Genscript | -- |
| Alexa-488标记抗兔抗体 | -- | -- | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | -- | -- | |
| 中和试验 | 兔抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗体 | Genscript | U739BGB150-5 |
| 重组LY-CoV555（Bamlanivimab） | -- | -- | |
| ELISA | Immulon 2HB板 | -- | -- |
| HRP标记山羊抗仓鼠IgG | Southern Biotech | 6060-05 | |
| 兔抗仓鼠IgA抗体 | Brookwood Biomedical | sab 3001a | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | Southern Biotech | 4030-05 | |
| ABTS/H2O2过氧化物酶底物 | SeraCare | -- | |
| ELISpot | 仓鼠IFN-γ ELISpotBASIC试剂盒 | MABTECH | 3102-2H |
| MSIP板 | Millipore | -- | |
| 伴刀豆球蛋白A | Sigma-Aldrich | -- | |
| TMB底物 | -- | 3651-10 | |
| 免疫荧光 | SARS核衣壳蛋白抗体 | Sino Biologicals | 40143-MM05 |
| MX1抗体 | Proteintech | 13750-1-AP | |
| 前表面活性蛋白C抗体 | EMD Millipore | AB3786 | |
| Iba1抗体 | Abcam | ab5076 | |
| RAGE抗体 | Abcam | ab216329 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | Abcam | ab219332 | |
| Alexa Fluor 488标记二抗 | ThermoFisher | A-21206 | |
| Alexa Fluor 647标记二抗 | ThermoFisher | A-31571 | |
| Alexa Fluor 647标记二抗 | ThermoFisher | A-21447 | |
| Hoechst 33342染料 | -- | -- | |
| 假病毒包装 | Lipofectamine 3000转染试剂 | -- | -- |
| 假病毒感染 | Leica Stellaris 5共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 组织匀浆 | Precellys Evolution组织匀浆仪 | Bertin | -- |
| RNA提取 | QIAamp vRNA迷你试剂盒 | QIAGEN | -- |
| RNeasy 96试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| 病毒滴定 | Cytation7成像读数仪 | Agilent | -- |
| ELISA | VersaMax酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| 免疫荧光 | NanoZoomer 2.0-RS全切片数字扫描仪 | Hamamatsu | -- |
| Axio Observer Z1倒置显微镜 | Carl Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 叙利亚仓鼠鼻内免疫 | 病毒剂量（100 PFU或10^4 PFU）、接种体积（50 µl）、仓鼠年龄（4-6月龄雄性） 阅读提示：Methods中Hamster challenge experiments小节及图1、图2图注 |
| 变异株攻击实验 | 攻击病毒株（Delta、BA.1、BA.2.12.1、BA.5）、攻击剂量（104 PFU或104 FFU）、攻击时间（免疫后35天或60天） 阅读提示：Methods中Hamster challenge experiments小节及图3、图8、图9图注 |
| 空气传播实验 | 供体与哨兵仓鼠配对比例、隔板设计、检测时间点（1-4 DPE鼻洗液） 阅读提示：Methods中Hamster challenge experiments小节及图7图注、Supplementary Movie 1 |
| 小鼠加强免疫实验 | MVA-S基础免疫剂量和间隔（两剂，8周后加强）、BA.1-LAV/BA.5-LAV剂量（10^4 PFU）、小鼠年龄（10周龄雄性BALB/c） 阅读提示：Methods中Boosting of MVA-vaccinated BALB/c mice with LAV小节及图10图注 |
| ELISA和中和抗体检测 | RBD包被浓度（1 µg/mL）、血清起始稀释度（1:160、1:80、1:20）、检测终点（OD405 0.02或0.05） 阅读提示：Methods中Measurement of antibody by ELISA和SARS-CoV-2 neutralization assay小节 |