PRMT5抑制调控lncRNA表达
验证PRMT5活性对lncRNA基因表达的影响。
用PRMT5抑制剂T1-44处理小鼠CT26细胞和人HCT116细胞，进行RNA-seq和RT-qPCR分析lncRNA表达变化。
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长非编码RNA来源的肽具有免疫原性并驱动强效抗肿瘤反应
Long non-coding RNA-derived peptides are immunogenic and drive a potent anti-tumour response.
实验完整度
高包含小鼠CT26细胞、人HCT116细胞、免疫肽组学、多聚核糖体分析、小鼠肿瘤模型及疫苗免疫验证。
主要模型
小鼠CT26结直肠癌细胞系 人HCT116结直肠癌细胞系 BALB/c小鼠colon26皮下肿瘤模型 BALB/c小鼠CT26皮下肿瘤模型
重点核对
T1-44处理浓度1 µM，处理时间48小时（HCT116）或72小时（CT26） T1-44口服给药剂量100 mg/kg，每日一次，持续19天 ChAdOx1-PepLnc疫苗接种剂量5×10^8 IU，静脉注射 MVA-PepLnc加强免疫剂量1×10^7 PFU，静脉注射 DC疫苗注射剂量1×10^6细胞/0.2 ml，静脉注射
摘要
蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）5在多种癌症中过表达，且主转录调节因子E2F1是一个重要的甲基化靶标。我们探索了PRMT5和E2F1在调控非编码基因组中的作用，并在此报告其对长非编码（lnc）RNA基因表达的显著影响。此外，许多MHC I类蛋白相关肽来源于lncRNA基因中的小开放阅读框。药理学抑制PRMT5或调节E2F1水平可定性改变肿瘤细胞展示的lncRNA衍生肽抗原库。当以离体负载的树突状细胞或从病毒载体表达的形式呈递给免疫系统时，lncRNA衍生肽驱动了强效的抗原特异性CD8 T淋巴细胞反应，转化为显著的肿瘤生长延迟。因此，lncRNA基因编码的免疫原性肽可作为癌症疫苗部署。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PRMT5和E2F1如何调控非编码基因组，以及lncRNA基因是否编码具有免疫原性的MHC I类相关肽并可用于抗肿瘤疫苗。
- 核心机制
- PRMT5和E2F1调控lncRNA基因表达，这些lncRNA可翻译成多肽并加工为MHC I类相关肽；PRMT5抑制或E2F1调节改变肽库，lncRNA衍生肽经MHC I类呈递可诱导抗原特异性CD8 T细胞反应。
- 主要证据
- 在CT26和HCT116细胞中通过RNA-seq和免疫肽组学鉴定lncRNA衍生MHC I类肽；多聚核糖体分析和ORF克隆验证翻译；小鼠疫苗实验显示CD8 T细胞反应和肿瘤生长延迟。
- 研究意义
- lncRNA基因编码的免疫原性肽可作为癌症疫苗，非编码基因组是肿瘤相关抗原的意外来源。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
E2F1调控lncRNA表达
验证E2F1对lncRNA基因表达的调控作用。
在细胞中转染E2F1 siRNA或使用E2F1 CRISPR敲除细胞，通过RT-qPCR和ChIP分析lncRNA表达及E2F1结合。
鉴定lncRNA编码的MHC I类相关肽
确定lncRNA基因是否产生MHC I类结合肽。
对T1-44处理或未处理的CT26和HCT116细胞进行免疫肽组学分析，匹配lncRNA翻译数据库。
验证lncRNA翻译
验证lncRNA转录本可翻译成多肽。
多聚核糖体分析和lncRNA ORF克隆表达FLAG标签蛋白，通过免疫印迹和免疫荧光检测。
评估lncRNA衍生肽的免疫原性
测试lncRNA衍生肽是否能诱导T细胞反应。
用ChAdOx1-PepLnc和MVA-PepLnc病毒载体免疫BALB/c小鼠，ELISpot检测IFNγ分泌。
评估疫苗抗肿瘤效果
测试lncRNA衍生肽疫苗是否延迟肿瘤生长。
使用ChAdOx1-PepLnc预防性疫苗或肽脉冲DC疫苗治疗colon26或CT26肿瘤小鼠，监测肿瘤体积。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | Labtech | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | T1-44 | Argonaut Therapeutics | -- |
| JNJ-64619178 | Selleck | -- | |
| LLY-283 | Selleck | -- | |
| 质粒转染 | GeneJuice转染试剂 | Novagen | -- |
| siRNA转染 | Oligofectamine转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Western blot | β-肌动蛋白抗体（克隆AC-74） | Sigma-Aldrich | -- |
| E2F1抗体（3742S） | Cell Signaling Technology | 3742S | |
| SDMe抗体（13222S） | Cell Signaling Technology | 13222S | |
| FLAG抗体（克隆M2，F1804） | Sigma | F1804 | |
| GAPDH抗体（克隆6C5，MAB374） | Millipore | MAB374 | |
| RNA提取 | TRIzol | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Direct-zol RNA小量制备试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| 逆转录 | SuperScript III逆转录酶 | Invitrogen | -- |
| qPCR | Brilliant III SYBR Green qPCR预混液 | Stratagene | -- |
| 免疫沉淀 | W6/32抗体 | ATCC | HB-95 |
| 34.1.2s抗体 | ATCC | HB-79 | |
| 质谱分析 | Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| ELISpot | INFγ单克隆抗体克隆AN18（3321-3-1000） | Mabtech | 3321-3-1000 |
| 生物素偶联抗INFγ（3321-6-100，克隆R4-6A2-Biotin） | MabTech | 3321-6-100 | |
| 链霉亲和素-碱性磷酸酶（3310-10-1000） | Mabtech | 3310-10-1000 | |
| 免疫组化 | CD8抗体（ab203035） | Abcam | ab203035 |
| CD4抗体（ab183685，克隆EPR19514） | Abcam | ab183685 | |
| CD163抗体（ab182422，克隆EPR19518） | Abcam | ab182422 | |
| 载体构建 | pSF-CMV-NEO-COOH-3xFLAG（OG629） | OxGene | OG629 |
| PCR | Phusion高保真DNA聚合酶（M0530S） | New England Biolabs | M0530S |
| PCR纯化 | QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- |
| 凝胶回收 | QIAquick凝胶回收试剂盒 | Qiagen | -- |
| 连接 | T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | -- |
| 细胞因子检测 | LEGENDplex MU Th细胞因子面板（12重）VbP V03（741044） | Biolegend | 741044 |
| 细胞分选 | MoFlo细胞分选仪 | Beckman Coulter | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PRMT5抑制处理 | T1-44浓度1 µM，处理时间48小时（HCT116）或72小时（CT26） 阅读提示：Methods 'Cell line generation, culture and compound treatments' |
| 小鼠肿瘤模型T1-44治疗 | T1-44口服给药100 mg/kg，每日一次，持续19天；肿瘤细胞接种数量5×10^5 colon26细胞 阅读提示：Methods 'Colon26 mouse tumour model with T1-44 treatment' |
| ChAdOx1-PepLnc免疫 | 剂量5×10^8 IU，静脉注射；免疫后9天检测 阅读提示：Methods 'ChAdOx1 and MVA immunogenicity' |
| DC疫苗治疗 | DC剂量1×10^6细胞/0.2 ml，静脉注射；肽脉冲浓度75 µg/ml（15个肽，每个5 µg/mL） 阅读提示：Methods 'Dendritic cell vaccine strategy in colon26 mouse tumour model' |