番茄染色质三维架构基础解析
明确番茄染色质的高级组织特征及转录工厂的存在。
对分离的番茄细胞核进行免疫荧光检测H3K9ac和H3K27me1；进行Hi-C和RNAPII ChIP-seq，并用抗RNAPII抗体进行HiChIP。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
HSFA1a调控植物热胁迫响应并改变增强子-启动子互作的三维染色质组织
HSFA1a modulates plant heat stress responses and alters the 3D chromatin organization of enhancer-promoter interactions.
实验完整度
高多组学（Hi-C、RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq、HiChIP、C-Hi-C、DAP-seq）结合遗传敲低、3C-qPCR及双荧光素酶功能验证。
主要模型
番茄M82品种4周龄植株第四叶 番茄Moneymaker品种hsfa1a敲低转基因株系（line1和line2） 本氏烟草叶片（瞬时表达）
重点核对
热胁迫处理温度45°C、时间1 h和6 h，对照为常温 hsfa1a敲低转基因株系（line1和line2）与野生型对照 RNA-seq、Hi-C、ATAC-seq、ChIP-seq、HiChIP、C-Hi-C均设两个独立生物学重复 3C-qPCR和双荧光素酶实验设三个生物学重复（3C-qPCR另设三个技术重复） C-Hi-C使用靶向212,735个启动子区域的生物素化RNA探针
摘要
染色质在细胞核内复杂且动态的三维组织使得理解基因表达调控具有挑战性，但也为表观遗传调控基因表达提供了可能途径。由于植物固着生长，它们进化出复杂机制以快速调节基因表达应对环境胁迫，这被认为由染色质构象变化协调以介导特定细胞和生理响应。然而，胁迫在多大程度上以及如何诱导染色质重组的动态变化仍知之甚少。本文全面研究了番茄中与热胁迫转录重编程响应相关的全基因组染色质变化。数据显示热胁迫诱导染色质架构的快速变化，导致启动子-增强子接触的瞬时形成，可能驱动热胁迫响应基因的表达。此外，我们证明染色质空间重组需要HSFA1a，一个对番茄耐热性必需的转录因子。基于我们的发现，我们提出转录因子通过启动子-增强子接触的三维重构在控制动态转录响应中发挥关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 热胁迫如何诱导番茄染色质三维组织的动态变化，以及这些变化如何调控热胁迫响应基因的转录重编程？
- 核心机制
- 热胁迫诱导染色质可及性变化和HSFA1a结合，促进启动子-增强子接触的瞬时形成，进而驱动热胁迫响应基因表达；HSFA1a是染色质空间重组所必需的。
- 主要证据
- Hi-C显示热胁迫减少组成型异染色质内互作并增强真染色质互作；C-Hi-C和HiChIP-RNAPII发现热胁迫诱导启动子-增强子环；hsfa1a敲低株系中3C-qPCR显示热诱导的增强子-启动子环强度显著降低；双荧光素酶实验证实RE具有增强子活性。
- 研究意义
- 提出转录因子通过三维重构启动子-增强子接触控制动态转录响应的模型，为理解植物胁迫响应中染色质空间组织调控基因表达提供证据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
热胁迫时间进程及转录组分析
确定热胁迫诱导的基因表达动态变化。
将4周龄番茄植株置于45°C处理1 h和6 h，取第四叶进行RNA-seq，并用自组织映射（SOM）分析差异表达基因。
热胁迫下染色质构象和可及性动态分析
探究热胁迫对染色质三维组织和可及性的影响。
相同热胁迫条件下进行Hi-C和ATAC-seq，分析A/B区室变化和染色质可及性动态。
远端和近端调控元件的染色质特征鉴定
区分远端和近端调控元件的组蛋白修饰特征并鉴定增强子。
在对照和热胁迫条件下进行ChIP-seq检测H3K4me3、H3K9ac、H3K18ac、H3K27ac和RNAPII，分析远端和近端可及区域的修饰模式。
启动子-调控元件三维互作的捕获与动态分析
鉴定热胁迫诱导的启动子-增强子接触类型及动态变化。
在热胁迫时间进程中进行C-Hi-C（靶向212,735个启动子）和RNAPII HiChIP，分析启动子中心枢纽和RE中心枢纽。
HSFA1a结合位点全基因组鉴定
确定HSFA1a的直接靶标及其与染色质可及性的关系。
使用AmpDAP-seq鉴定HSFA1a结合位点，整合ATAC-seq和RNA-seq数据分析。
HSFA1a功能缺失对热胁迫响应及染色质环形成的影响
验证HSFA1a在热胁迫耐受和启动子-增强子环形成中的作用。
使用两个独立hsfa1a敲低株系进行热胁迫表型观察、RNA-seq和3C-qPCR，检测Solyc09g074475和HSFA2位点的染色质环强度。
候选增强子活性验证
验证与热响应基因互作的远端调控元件是否具有增强子活性。
将候选RE序列与mini35S::LUC报告基因融合，在本氏烟草叶片中进行瞬时双荧光素酶 assay。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证转录因子结合
验证增强子活性
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光染色 | 抗H3K9me2抗体 | Abcam | ab1220 |
| 抗H3K9ac抗体 | Millipore | 07-352 | |
| 抗H3K27me1抗体 | Millipore | 07-448 | |
| 抗RNAPII抗体 | Abcam | ab26721 | |
| 山羊抗兔Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A11034 | |
| 山羊抗鼠Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32727 | |
| 山羊抗兔Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | |
| 山羊抗鼠Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| SlowFade Diamond抗淬灭封片剂 | -- | -- | |
| ATAC-seq | Tn5转座酶 | Illumina | FC-121-1030 |
| Qiagen MinElute试剂盒 | QIAGEN | 28004 | |
| RNA-seq | Nucleospin RNA提取试剂盒 | Macherey-Nagel | -- |
| NEBNext Ultra II定向RNA文库构建试剂盒 | NEB | -- | |
| in situ Hi-C | DpnII限制性内切酶 | New England Biolabs | -- |
| NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 | NEB | -- | |
| C-Hi-C | SureSelect XT靶向富集系统 | Agilent | -- |
| HiChIP | 抗RNAPII抗体 | Abcam | ab26721 |
| ChIP-seq | 抗H3K27me1抗体 | Millipore | 07-448 |
| 抗H3K9ac抗体 | Millipore | 07-352 | |
| 抗H3K14ac抗体 | Millipore | 07-353 | |
| 抗H3K18ac抗体 | Millipore | 07-354 | |
| 抗H3K27ac抗体 | Abcam | ab4729 | |
| 抗H3K4me3抗体 | Millipore | 07-473 | |
| 抗RNAPII抗体 | Abcam | ab26721 | |
| NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 | NEB | -- | |
| AmpDAP-seq | NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 | NEB | E7645S/L, E7103S/L |
| pIX-HALO表达载体 | -- | -- | |
| Promega TNT偶联小麦胚芽提取物系统 | Promega | L4130 | |
| Magne HALO-Tag磁珠 | Promega | G728A | |
| 3C-qPCR | DpnII限制性内切酶 | New England Biolabs | -- |
| T4 DNA连接酶 | Fermentas | -- | |
| 双荧光素酶实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E2920 |
| 测序 | NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- |
| 文库质控 | 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| 热胁迫处理 | 气候箱 | Aralab | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 植物材料与热胁迫处理 | 番茄品种（M82和Moneymaker）、植株年龄（4周）、处理温度（45°C）、处理时间（1 h和6 h）、取样部位（第四叶） 阅读提示：Methods中Plant material and growth conditions小节 |
| hsfa1a敲低株系验证 | 敲低株系来源（Dr. Fragkostefanakis实验室）、株系编号（line1和line2）、敲低效率验证方法（文中未明确说明） 阅读提示：Methods中Plant material and growth conditions小节及Supplementary Fig. 23 |
| C-Hi-C和HiChIP | C-Hi-C探针设计（靶向212,735个启动子，探针长120 bp）、HiChIP抗体用量（3 μg抗RNAPII）、生物学重复数（2个） 阅读提示：Methods中C-Hi-C assay和HiChIP assay小节 |
| 3C-qPCR | 交联条件（1%甲醛，20 min）、酶切用量（150 U DpnII）、连接用量（4000 U T4 DNA ligase）、生物学重复（3个）和技术重复（3个） 阅读提示：Methods中3C-qPCR小节及Fig. 5f, h图注 |
| 双荧光素酶实验 | 报告基因构建（RE-mini35S::LUC）、对照（mini35S::LUC）、转化宿主（本氏烟草）、生物学重复（3个） 阅读提示：Methods中Dual-luciferase assay小节及Fig. 5e, g图注 |
| AmpDAP-seq | HSFA1a开放阅读框来源（SolycHsfA1a）、体外表达系统（小麦胚芽提取物）、磁珠（Magne HALO-Tag）、生物学重复（2个） 阅读提示：Methods中Amplified DNA affinity purification sequencing assay小节 |