构建mTORC1信号缺陷小鼠模型
研究mTORC1在肺分支形态发生中的作用。
利用ShhCre介导Rptor flox等位基因在肺上皮中敲除，通过免疫荧光检测pRPS6验证mTORC1活性降低。
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mTORC1信号促进差异性干细胞分化以塑造发育中的小鼠肺，并与线粒体能力相关
mTORC1 signaling facilitates differential stem cell differentiation to shape the developing murine lung and is associated with mitochondrial capacity.
实验完整度
高使用多种条件性基因敲除小鼠模型，结合免疫荧光、RNA-Seq、mtDNA/ATP检测及功能验证。
主要模型
Rptorf/f; ShhCre/+小鼠（mTORC1缺陷） Tfamf/f; ShhCre/+小鼠（线粒体功能缺陷） Cox10f/f; ShhCre/+小鼠（线粒体功能缺陷） Shh−/−小鼠（Hedgehog信号缺陷）
重点核对
条件性敲除小鼠的基因型及Cre重组效率（如pRPS6信号降低验证Rptor敲除） 肺上皮细胞的纯化方法（EpCAM抗体偶联磁珠）及纯度 mtDNA/nDNA比值检测中使用的基因（16S rRNA、mtND1、Hk2）及qPCR条件 ATP产量测定方法及样本时间点（13.5 dpc和17.5 dpc） RNA-Seq分析的时间点（11.5 dpc和14.5 dpc）及差异基因分析流程
摘要
分支器官的形成需要干细胞的序贯分化。本研究发现，小鼠肺中源自SOX2+祖细胞的传导气道在缺乏mTOR复合物1（mTORC1）信号时无法形成，并被肺囊肿所取代。远端SOX9+祖细胞向近端SOX2+细胞的转变所介导的近端-远端模式形成被破坏。线粒体数量和ATP产生减少。线粒体能力受损导致与mTORC1缺陷肺相似的缺陷。这表明mTORC1通过调节线粒体能力促进SOX9+祖细胞分化以形成传导气道。令人惊讶的是，在所有突变体中，尽管分支有缺陷，囊泡在适当的发育时间仍由肺囊肿产生。SOX9+祖细胞也在囊泡内分化为肺泡上皮I型和II型细胞。这些发现突出了干细胞分化过程中能量和调控程序的选择性利用，以产生哺乳动物肺的独特结构。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- mTORC1信号如何调控肺分支形态发生和干细胞分化，以及能量利用在其中的作用。
- 核心机制
- mTORC1通过维持线粒体能力和ATP产生，促进远端SOX9+祖细胞向近端SOX2+细胞转变以形成传导气道，该过程涉及Hedgehog信号通路；而囊泡形成和AT1/AT2分化不依赖此转变。
- 主要证据
- 在Rptor、Tfam、Cox10及Shh突变小鼠中，传导气道缺失而被囊肿取代，但囊泡样结构仍能形成并包含AT1/AT2细胞；RNA-Seq显示Hh通路下调，Shh−/−表型相似。
- 研究意义
- 揭示了不同细胞过程对能量依赖的差异性，为研究器官形成中的能量利用和发育时钟提供了框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估肺分支形态和细胞行为
确定mTORC1缺失对分支形态、细胞增殖和极性的影响。
全肺成像和免疫荧光观察分支结构、EdU掺入检测增殖、phalloidin/pMLC2/PKCζ染色评估极性。
分析SOX2/SOX9祖细胞分布
探究mTORC1缺失是否影响近端-远端模式形成。
全肺免疫荧光染色SOX2和SOX9，定量SOX2+和SOX9+区域面积。
检测囊泡形成和AT1/AT2分化
验证mTORC1缺失是否影响囊泡形成及肺泡上皮细胞分化。
全肺成像和免疫荧光检测SPC（AT2）、T1α/HOPX（AT1）及气道细胞标志物（CC10、Ac-tub）。
RNA-Seq分析转录组变化
寻找mTORC1下游效应通路。
对对照和Rptorf/f; ShhCre/+肺进行bulk RNA-Seq，分析差异基因和GO通路。
评估线粒体能力和ATP产生
确定mTORC1缺失是否影响线粒体功能。
纯化肺上皮细胞，检测mtDNA/nDNA比值、ATP产量，免疫荧光检测MTCO1和MPC1。
构建线粒体功能缺陷小鼠模型
验证线粒体能力下降是否足以模拟mTORC1缺失表型。
利用ShhCre敲除Tfam或Cox10，检测分支、SOX2/SOX9分布、囊泡形成和AT1/AT2分化。
验证Hedgehog通路下游作用
探究Hh信号是否介导mTORC1-线粒体轴对传导气道形成的影响。
分析Shh−/−小鼠肺表型，并与mTORC1或线粒体突变体比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光 | 鸡抗GFP抗体 | abcam | ab13970 |
| 兔抗NKX2.1抗体 | Epitomics | 2044-1 | |
| 羊抗CC10抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9773 | |
| 小鼠抗乙酰化微管蛋白抗体 | MilliporeSigma | T6793 | |
| 兔抗前表面活性蛋白C抗体 | MilliporeSigma | AB3786 | |
| 仓鼠抗T1α抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 8.1.1 | |
| 小鼠抗HOPX抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-398703 | |
| 小鼠抗p63抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8431 | |
| 兔抗MPC1抗体 | MilliporeSigma | HPA045119 | |
| 大鼠抗E-钙黏蛋白抗体 | Life Technologies | 13-1900 | |
| 小鼠抗β-连环蛋白抗体 | BD Transduction Laboratories | 610154 | |
| 小鼠抗MTCO1抗体 | abcam | ab14705 | |
| 小鼠抗GM130抗体 | BD Biosciences | 610822 | |
| 小鼠抗ACTA2抗体 | Thermo Scientific Lab Vision | MS-113-P0 | |
| 大鼠抗PECAM-1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-18916 | |
| 兔抗PDGFRA抗体 | Cell Signaling Technology | 3164 | |
| 小鼠抗S6核糖体蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| 兔抗磷酸化S6核糖体蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4856 | |
| 兔抗SOX2抗体 | Cell Signaling Technology | 23064 | |
| 羊抗SOX9抗体 | R&D Systems | AF3075 | |
| 兔抗磷酸化MLC抗体 | Cell Signaling Technology | 3671 | |
| 兔抗PKCζ抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-216 | |
| Alexa Fluor 488驴抗鸡抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 703-546-155 | |
| Alexa Fluor 488驴抗羊抗体 | Life Technologies | A11055 | |
| Alexa Fluor 488驴抗小鼠抗体 | Life Technologies | A21202 | |
| Alexa Fluor 594驴抗小鼠抗体 | Life Technologies | A21203 | |
| Alexa Fluor 647驴抗小鼠抗体 | Life Technologies | A31571 | |
| Alexa Fluor 488驴抗兔抗体 | Life Technologies | A21206 | |
| Alexa Fluor 594驴抗兔抗体 | Life Technologies | A21207 | |
| Alexa Fluor 594驴抗大鼠抗体 | Life Technologies | A21209 | |
| 生物素化羊抗仓鼠抗体 | Vector Laboratories | BA-9100 | |
| 生物素化驴抗兔抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-065-152 | |
| 生物素化驴抗大鼠抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-065-150 | |
| 生物素化马抗小鼠抗体 | Vector Laboratories | BA-2000 | |
| 链霉亲和素Alexa Fluor 488偶联物 | Life Technologies | S11223 | |
| 链霉亲和素Alexa Fluor 594偶联物 | Life Technologies | S11227 | |
| 链霉亲和素Alexa Fluor 647偶联物 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 016-600-084 | |
| HRP偶联链霉亲和素 | Perkin-Elmer | NEL753001KT | |
| F-actin染色 | 罗丹明偶联鬼笔环肽 | Thermo Fisher | R415 |
| 细胞增殖检测 | EdU | Research Products International | B71800-1.0 |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像试剂盒 | Thermo Fisher | C10337 | |
| 肺上皮细胞纯化 | 分散酶 | BD Biosciences | 354235 |
| 胶原酶B | Roche | 11088815001 | |
| DNase I | QIAGEN | 79254 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Mediatech | 10-013-CV |
| 胎牛血清 | Gibco | 10437-028 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15070-063 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-081 | |
| 肺上皮细胞纯化 | 生物素化EpCAM抗体 | eBioscience | 13-5791-82 |
| Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠 | Invitrogen | 11205D | |
| Western blotting | 兔抗Raptor抗体 | EMD Millipore Corporation | 09-217 |
| 兔抗MLC2抗体 | Cell Signaling Technology | 3672 | |
| 羊抗TFAM抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23588 | |
| 兔抗COX10抗体 | Proteintech | 10611-2-AP | |
| 小鼠抗α-微管蛋白抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Ambion | 15596018 |
| RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | 74104 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型构建 | 条件性敲除小鼠的基因型（Rptorf/f; ShhCre/+等）及Cre重组效率验证（pRPS6信号降低） 阅读提示：Methods'Animal husbandry'及Results相关段落，Figure 1a-b |
| EdU增殖检测 | EdU注射剂量（300 μl 5 mg/ml）、注射时间（解剖前1小时）、检测时间点及计数方法 阅读提示：Methods'Cell proliferation assays' |
| 肺上皮细胞纯化 | 消化酶组合（dispase、collagenase B、DNase I）及浓度、EpCAM抗体浓度、磁珠用量 阅读提示：Methods'Purification of lung epithelial cells' |
| mtDNA/nDNA比值检测 | 引物序列（16S rRNA、mt-ND1、Hk2）、qPCR条件及样本时间点（13.5和17.5 dpc） 阅读提示：Methods'Analysis of mtDNA/nDNA ratio' |
| RNA-Seq分析 | 测序平台（BGISEQ-500）、分析软件（RStudio）及差异基因分析参数 阅读提示：Methods'RNA-Seq analysis' |