基于结构的虚拟筛选与分子设计
寻找靶向CRY1 PHR结构域初级口袋（FAD结合口袋）的小分子。
对小鼠CRY1晶体结构（PDB ID: 4K0R）进行分子动力学模拟，以平衡后的初级口袋为受体，从Ambinter库中筛选约200万个小分子（经Lipinski五规则过滤），使用AutoDock Vina对接，根据结合能选取前200个化合物。
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发现一种小分子M47选择性 destabilizes Cryptochrome 1并延长p53敲除小鼠寿命
Discovery of a small molecule that selectively destabilizes Cryptochrome 1 and enhances life span in p53 knockout mice.
实验完整度
高包含体外细胞模型、CRISPR敲除细胞、小鼠肝脏亚细胞分级、p53−/−小鼠生存分析及多种功能与机制验证。
主要模型
U2OS Bmal1-dLuc细胞 HEK293T细胞 p53−/−小鼠 Ras转化p53缺失小鼠皮肤成纤维细胞
重点核对
M47剂量依赖性缩短CRY1::LUC半衰期但不影响CRY2::LUC CRY1敲除U2OS Bmal1-dLuc细胞中M47不再延长周期，而CRY2敲除细胞中仍延长 M47增加CRY1泛素化水平 M47处理p53−/−小鼠的生存期显著高于 vehicle 组（中位寿命29.5周 vs 24周） M47在p53缺失MSF细胞中增强奥沙利铂诱导的Caspase-3活性和PARP切割
摘要
Cryptochromes是哺乳动物生物钟的负转录调节因子。目前尚不清楚降低哺乳动物内源性CRY1水平会如何影响昼夜节律以及这种降低与凋亡的关系。在这里，我们发现了一种分子（M47），它在体外和体内均能不稳定化Cryptochrome 1（CRY1）。M47通过增加CRY1的泛素化选择性增强CRY1的降解速率，并导致U2OS Bmal1-dLuc细胞的昼夜节律周期长度增加。此外，小鼠肝脏的亚细胞分级研究表明，M47增加了细胞核中CRY1的降解。进一步，M47介导的CRY1减少增强了奥沙利铂诱导的Ras转化p53缺失成纤维细胞凋亡。系统性重复给药M47使p53−/−小鼠的中位寿命延长约25%。总之，我们的数据表明M47是一种有前景的分子，可用于治疗依赖p53突变的癌症类型。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 降低哺乳动物内源性CRY1水平如何影响昼夜节律，以及这种降低与凋亡的关系是什么？
- 核心机制
- M47结合CRY1的PHR结构域初级口袋，通过增加CRY1泛素化选择性促进其降解，并提高PER2等钟控基因转录。
- 主要证据
- 体外CRY1::LUC降解实验、CRY1/CRY2敲除U2OS细胞周期监测、泛素化实验、小鼠肝脏亚细胞分级Western blot、p53缺失MSF细胞凋亡检测以及p53−/−小鼠Kaplan-Meier生存分析。
- 研究意义
- 提示M47可作为治疗依赖p53突变的癌症类型的候选分子，并可能用于CRY1相关的其他疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选影响CRY1半衰期的小分子
鉴定能改变CRY1稳定性并影响昼夜节律周期的分子。
用MTT assay在U2OS Bmal1-dLuc细胞中评估候选分子毒性，排除2.5 µM下细胞活力<90%的分子；用实时生物发光监测筛选改变周期≥1小时的分子；再用CRY1::LUC降解实验测定半衰期，选出M47进行后续表征。
验证M47对CRY1的选择性降解与结合
确认M47通过CRY1而非CRY2发挥作用，并验证其结合位点。
在HEK293T细胞中用CRY1::LUC和CRY2::LUC降解实验测定半衰期；用CRISPR/Cas9构建CRY1 KO、CRY2 KO和DKO U2OS Bmal1-dLuc细胞监测周期；用定点突变CRY1-R293A-W399L验证结合残基；用生物素化M47进行pull-down和LC-MS/MS鉴定结合蛋白；用泛素化实验检测CRY1泛素化水平。
评估M47在细胞和小鼠肝脏中对核心钟蛋白的影响
检测M47对内源性CRY1蛋白和mRNA水平以及钟控基因表达的影响。
在同步化U2OS细胞中，用10 µM M47处理，于同步化后24–48小时每4小时收样，Western blot检测CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1蛋白，RT-qPCR检测Cry1、Cry2、Dbp、Per2 mRNA；小鼠i.p.注射25或50 mg/kg M47，6小时后取肝脏，进行亚细胞分级和Western blot检测CRY1，RT-PCR检测Per2 mRNA。
评估M47在p53缺失细胞中增强奥沙利铂诱导的凋亡
验证M47降解CRY1是否增强p53缺失细胞对凋亡信号的敏感性。
Ras pT24转化p53缺失MSF细胞或野生型MSF细胞先用5 µM M47或DMSO处理24小时，再用0、10、20 µM奥沙利铂处理16小时，检测PARP切割（Western blot）和Caspase-3活性（EnzChek Caspase-3 Assay Kit #2）。
评估M47在p53−/−小鼠中的毒性、药代动力学和生存获益
确定M47的体内耐受性、药代动力学特征及其对p53−/−小鼠寿命的影响。
在C57BL/6J小鼠中进行单剂量毒性（5、50、300、1000 mg/kg i.p.）、5天最大耐受量（40、80、150 mg/kg i.p.）和14天亚急性毒性（60 mg/kg i.p.）实验；进行100 mg/kg单剂量药代动力学和脑组织分布检测；对p53−/−小鼠以50 mg/kg/day i.p.、每周5天、连续7周给药，进行Kaplan-Meier生存分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与处理 | 地塞米松 | -- | -- |
| 实时生物发光监测 | DMEM粉末 | sigma | D-2902 |
| 碳酸氢钠 | sigma | S5761 | |
| D(+)葡萄糖粉末 | sigma | G7021 | |
| HEPES缓冲液 | Gibco | 15140-122 | |
| 荧光素 | -- | -- | |
| Western blot | CRY1抗体 | Bethyl | A302-614A |
| CRY2抗体 | Bethyl | A302–615A | |
| CLOCK抗体 | Bethyl | A302–618A | |
| BMAL1抗体 | Santa Cruz | sc-365645 | |
| 抗Myc抗体 | Abcam | ab18185 | |
| 抗His抗体 | Santa Cruz | SC-8036 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling | 8H10D10 | |
| α-微管蛋白抗体 | Sigma | T9026 | |
| 组蛋白H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| 鼠二抗 | Santa Cruz | SC-358920 | |
| 兔二抗 | Cell Signaling | 7074 | |
| ECL缓冲液系统 | Advansta | -- | |
| 泛素化实验 | EZview Red抗c-Myc亲和凝胶 | SIGMA-ALDRICH | E6654 |
| 抗HA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc7392 | |
| 抗Gal4(DBD)抗体 | Santa Cruz | sc-577 | |
| 凋亡检测 | EnzChek Caspase-3检测试剂盒#2 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗PARP抗体 | Cell Signaling | 9542 | |
| Pull-down实验 | NeutrAvidin琼脂糖树脂 | Thermo Scientific | -- |
| 生物素化M47 | Enamine | -- | |
| CRY1/CRY2敲除细胞构建 | LentiCRISPRv2质粒 | Addgene | 52961 |
| 抗CRY1抗体 | Bethyl Labs Inc. | A302-614A | |
| 抗CRY2抗体 | Bethyl Labs | A302-615A | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | CST-4967S | |
| WesternBright Sirius HRP底物 | Advansta | K-12043-D20 | |
| 小鼠体温监测 | 直肠恒温监测仪 | Harvard Apparatus | -- |
| M47制剂 | Cremophor EL | -- | -- |
| 药代动力学分析 | 氯雷他定（内标） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRY1::LUC降解实验 | M47处理浓度与时间、CHX浓度（20 µg/ml）、HEK293T细胞转染质粒量（40 ng）、生物发光读取条件（32°C，每10分钟，24小时） 阅读提示：Methods中CRY-LUC degradation assay小节及图2A、2B图注 |
| CRY1/CRY2敲除U2OS细胞周期监测 | sgRNA序列、嘌呤霉素筛选浓度（0.5 mg/mL）、M47处理浓度、实时生物发光监测条件（LumiCycle，37°C，每10分钟） 阅读提示：Methods中Generation of CRYs knockout U2OS cell lines小节及图2C、2D图注 |
| M47与CRY1结合验证（Pull-down） | bM47浓度（50 µM）、竞争剂M47浓度（100 µM）、孵育时间（2小时）、NeutrAvidin琼脂糖用量 阅读提示：Methods中Investigation the interaction between M47 and CRYs小节及图3A、3B图注 |
| 小鼠肝脏CRY1降解检测 | M47剂量（25、50 mg/kg i.p.）、取样时间（注射后6小时）、亚细胞分级缓冲液组成、Western blot抗体稀释比例 阅读提示：Methods中Protein immunoblots小节及图7图注 |
| p53−/−小鼠生存分析 | M47剂量（50 mg/kg/day）、给药频率（每周5天，连续7周）、给药时间（ZT17）、小鼠样本量（M47组n=9，vehicle组n=7）、生存分析统计方法（Kaplan-Meier log-rank test） 阅读提示：Methods中Determination the survival curve in p53−/− mice in the presence of M47小节及图8C图注 |
| M47药代动力学检测 | 给药剂量（100 mg/kg i.p.）、采血时间点（0、0.5、1、2、4、8、12、24小时）、LC-MS/MS质谱参数（m/z 472.1→353.4，CE=22 eV） 阅读提示：Methods中Pharmacokinetic studies和Assessment of M47 concentrations in plasma and the brain小节及表2 |