合成探针库并进行泛素探针竞争筛选
从腈类DUB抑制剂衍生探针中筛选能共价结合DUB的候选化合物。
合成7种含炔基的活性探针，在HEK293裂解液中先用或不用Ub-VS预处理，再与探针孵育，通过点击化学和SDS-PAGE可视化探针结合蛋白。
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特异性抑制去泛素化酶UCHL1的结构基础
Structural basis for specific inhibition of the deubiquitinase UCHL1.
实验完整度
高包含重组蛋白体外抑制、细胞水平靶点占据与表型、晶体结构解析及突变验证等多个独立证据层级
主要模型
HEK293细胞 U-87 MG人胶质母细胞瘤细胞 重组人UCHL1蛋白 甲基化UCHL1与GK13S复合物晶体
重点核对
GK13S对重组UCHL1的IC50为50 nM，GK16S的IC50 >100 μM GK13S共价结合UCHL1催化半胱氨酸Cys90，形成异硫脲连接 细胞中1 μM GK13S处理24小时可近乎完全抑制UCHL1，5 μM实现完全抑制 U-87 MG细胞中5 μM GK13S处理48小时降低单泛素水平，GK16S无此效应 晶体结构中GK13S诱导UCHL1形成apo与泛素结合状态的混合构象
摘要
泛素化调控蛋白质稳态，并受到去泛素化酶（DUB）的严格调控。DUB UCHL1的缺失会导致神经退行性变，而其失调则促进癌症转移和侵袭。UCHL1及DUB的小分子探针有助于研究其功能，但特异性抑制剂和结构信息仍然稀缺。在这里，我们报道了针对UCHL1的高效且无毒的化学基因组学探针对GK13S和GK16S。GK13S的生化表征表明其对细胞UCHL1具有立体选择性抑制。UCHL1与GK13S复合物的晶体结构显示，该酶被锁定在apo和泛素结合状态的混合构象中，这构成了其在UCH DUB家族中对UCHL1特异性的基础。模拟小鼠中已报道的UCHL1失活突变，GK13S而非GK16S导致人胶质母细胞瘤细胞系中单泛素水平降低。总之，我们介绍了一组经过结构表征的化学基因组学探针，适用于UCHL1的细胞研究。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- UCHL1特异性小分子抑制剂的结构基础是什么，以及能否利用化学基因组学探针在细胞中研究UCHL1功能。
- 核心机制
- GK13S通过共价修饰UCHL1催化Cys90并占据泛素C端结合裂隙，将UCHL1锁定在apo与泛素结合状态混合的构象中；UCHL1特异的apo构象残基（如Ile8、Phe160）与结合口袋差异共同决定了其对UCH家族的选择性。
- 主要证据
- 重组UCHL1的IC50和kobs/[I]测定、细胞HA-Ub-VS竞争实验、U-87 MG细胞单泛素水平Western blot、UCHL1~GK13S晶体结构（2.24 Å）以及UCHL3突变体和UCHL1结合位点突变体的探针标记验证。
- 研究意义
- 提供了一组结构表征的、无毒的化学基因组学探针，适用于UCHL1的细胞功能研究；结构信息为合理改进UCHL1抑制剂的效力和选择性提供了基础，并提示不同DUB家族中可能存在配体结合热点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估探针在细胞中的选择性和靶点
确定GK13S等探针在完整细胞中的主要靶点和立体选择性。
用不同浓度探针处理完整HEK293细胞24小时，进行活性蛋白质谱分析；并通过HA-Ub-VS竞争、siRNA敲低和过表达突变体验证靶点。
体外测定GK13S对UCHL1的抑制效力和共价结合模式
定量GK13S对重组UCHL1的抑制效力、动力学常数和结合化学计量。
使用Ub-Rhodamine 110切割实验测定IC50，kobs/[I]动力学实验，完整蛋白质谱检测共价结合，热位移实验和跳稀释/透析实验验证不可逆性。
在U-87 MG细胞中验证UCHL1抑制的表型
检验GK13S抑制UCHL1是否模拟UCHL1突变小鼠中单泛素水平降低的表型。
用GK13S或GK16S处理U-87 MG细胞，Western blot检测单泛素水平；同时用siRNA敲低UCHL3或PARK7以检验特异性。
解析UCHL1与GK13S复合物晶体结构
从结构层面揭示GK13S抑制UCHL1的效力和特异性基础。
对UCHL1进行赖氨酸甲基化，与GK13S共结晶，收集X射线衍射数据，通过分子置换解析结构并精修。
通过突变验证结合位点和家族特异性决定残基
验证晶体结构中观察到的关键残基对GK13S结合和UCHL1选择性的贡献。
在HEK293细胞中过表达UCHL1结合位点突变体和UCHL3突变体（A11I、L168F及双突变），用GK13S进行活性蛋白质谱分析；并纯化UCHL3双突变体进行体外抑制实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估细胞表型
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 分子克隆 | In-Fusion HD克隆试剂盒 | Takara Clonetech | -- |
| 定点突变 | Phusion聚合酶 | New England BioLabs | -- |
| 蛋白纯化 | HisTrap柱 | GE Healthcare | 5 mL |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg柱 | GE Healthcare | -- | |
| ResQ柱 | GE Healthcare | -- | |
| ÄKTA Pure系统 | GE Healthcare | -- | |
| 蛋白浓度测定 | Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | -- |
| 结晶筛选 | mosquito HTS机器人 | TTP Labtech | -- |
| 结晶板 | MRC格式96孔坐滴气相扩散板 | Molecular Dimensions | -- |
| Ub-Rhodamine assay | Ub-Rhodamine 110 | Biomol | -- |
| 荧光检测 | Tecan Spark酶标仪 | Tecan | -- |
| 完整蛋白质谱 | MassPrep在线脱盐柱 | Waters | 2.1 mm × 10 mm |
| AdvanceBio脱盐反相柱 | Agilent | 2.1 mm × 12.5 mm | |
| Velos Pro双压线性离子阱质谱仪 | ThermoFisher | -- | |
| Agilent 1260 II Infinity系统 | Agilent | -- | |
| 热位移实验 | SYPRO Orange | -- | -- |
| Bio-Rad Connect循环仪 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM） | -- | -- |
| 胎牛血清（FBS） | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| F-12K Nut Mix培养基 | -- | -- | |
| 转染 | PEI转染试剂 | Polysciences | -- |
| OPTI-MEM培养基 | -- | -- | |
| siRNA敲低 | siGENOME非靶向siRNA对照池 | Dharmacon | D-001206-13-05 |
| siGENOME人UCHL1 siRNA | Dharmacon | M-004309-00-0005 | |
| siGENOME人PARK7 siRNA | Dharmacon | M-005984-00-0005 | |
| siGENOME人UCHL3 siRNA | Dharmacon | M-006059-02-0005 | |
| siRNA转染 | RNAiMAX | Thermo Fisher | -- |
| 细胞活力检测 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| Incucyte S3 | -- | -- | |
| 活性蛋白质谱分析 | HA-Ub-VS | -- | -- |
| 点击化学 | 5/6-TAMRA-叠氮-生物素 | Jena Bioscience | -- |
| BTTAA | -- | -- | |
| 五水硫酸铜 | -- | -- | |
| 抗坏血酸钠 | -- | -- | |
| SDS-PAGE | 4–12% Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | NuPAGE |
| MES SDS电泳缓冲液 | -- | -- | |
| 荧光成像 | ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- |
| Western blot | Trans-Blot Turbo系统 | Bio-Rad | -- |
| 抗UCHL1抗体 | Cell Signaling | D3T2E | |
| 抗PARK7抗体 | Cell Signaling | D29E5 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Sigma | T6199 | |
| 抗血凝素抗体 | BioLegend | 16B12 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F3165 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling | P4D1 | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz | sc-8017 | |
| 抗UCHL3抗体 | Proteintech | 12384-1-AP | |
| 抗小鼠二抗 | Sigma | NXA931 | |
| 抗兔二抗 | Sigma | GENA934 | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| 质谱样品制备 | NeutrAvidin珠浆 | Thermo Fisher | -- |
| LysC | Serva Biotech | -- | |
| 胰蛋白酶 | Sigma Aldrich | -- | |
| 质谱分析 | Ultimate 3000 RSLC纳升液相系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive Plus混合轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| C18 PepMap 100柱 | Dionex | 5 μm, 100 Å, 300 μm ID * 5 mm | |
| C18 PepMap 100柱 | Dionex | 3 μm, 100 Å, 75 μm ID × 50 cm | |
| Pico Tip发射器 | New Objective | ID 20 μm, Tip-ID 10 μM | |
| 单泛素定量 | Fast Green FCF | TCI | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 探针体外抑制UCHL1 | UCHL1终浓度0.06 nM，Ub-Rhodamine 110终浓度50 nM，化合物预孵育1小时，DMSO终浓度0.1–1% 阅读提示：Methods 'Ub-Rhodamine assay'小节 |
| 细胞UCHL1抑制 | HEK293或U-87 MG细胞，GK13S浓度1 μM或5 μM，处理24小时，HA-Ub-VS终浓度1 μM，标记30分钟37°C 阅读提示：Methods 'Cellular Ub-probe competition'小节及Fig. 3e、Fig. 4d图注 |
| U-87 MG单泛素水平检测 | 化合物浓度5 μM，处理48小时，每24小时更换培养基，siRNA转染条件 阅读提示：Methods 'Quantification of monoubiquitin levels in U-87 MG cells'小节及Fig. 4e、f图注 |
| 共结晶与结构解析 | 甲基化UCHL1浓度30 mg/mL，GK13S 1.2当量，结晶条件2.3 M硫酸铵、110 mM K3PO4、90 mM K2HPO4，冷冻保护剂3 M sodium malonate pH 7.0含1 mM GK13S 阅读提示：Methods 'Co-crystallization'和'Data collection, structure solution and refinement'小节，Table 1 |
| 突变体验证 | Flag-UCHL1或Flag-UCHL3突变体在HEK293细胞中过表达，化合物浓度1 μM处理1小时，活性蛋白质谱分析 阅读提示：Methods 'Transfection'和'Cellular activity-based protein profiling'小节，Fig. 5k、Fig. 6e图注 |