生成并验证F1杂交iPSC系
建立雌雄同源的iPSC系，并确认其多能性和核型正常。
从i4F-BL6雌鼠与CAST/EiJ雄鼠杂交的E13.5胚胎中分离MEFs，在KSR或FBS培养基中用DOX诱导重编程12天，挑取克隆并扩增至约第50天；通过多能性标志物表达、RNA-seq、免疫荧光、核型和畸胎瘤实验进行验证。
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小鼠iPSCs的印记保真度取决于供体细胞性别和培养基配方
Imprinting fidelity in mouse iPSCs depends on sex of donor cell and medium formulation.
实验完整度
高使用雌雄F1杂交iPSC系、多种培养基、IMPLICON、RNA-seq、LC-MS/MS、焦磷酸测序及畸胎瘤实验，含功能与机制验证。
主要模型
雌性和雄性F1杂交小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）来源的iPSC系 TX1072雌性小鼠胚胎干细胞（TX 2i ESCs） NSG小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
iPSC系数量：KSR-iPSCs雌雄各6个克隆；FBS-iPSCs雌雄各5个克隆；KSR/FBS-iPSCs和FBS+VitC-iPSCs各6个克隆 重编程条件：DOX 1.5 µg/ml诱导12天，第12天挑克隆，扩增至约第50天 印记甲基化检测：IMPLICON分析13个印记簇及对照区域，等位基因特异性分辨率 培养基差异：KSR、FBS、KSR/FBS（1:1）、FBS+0.5 µM维生素C 体内分化验证：2×10^6细胞皮下注射NSG小鼠，每个细胞系2个畸胎瘤
摘要
将体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）是迈向疾病建模和细胞替代治疗个性化方法的重要一步。然而，我们仍缺乏完全控制iPSCs表观遗传状态的能力，这是其下游应用的主要障碍。表观遗传保真度可以通过基因组印记来追踪，这是一种依赖于DNA甲基化的现象，在iPSCs中经常因未知原因而受到干扰。为了试图理解这些缺陷的原因，我们使用IMPLICON（一种测量DNA甲基化水平的高通量方法）在多种不同实验条件下产生的雌性和雄性小鼠iPSC系中进行了全面的印记分析。我们的结果表明，印记缺陷在iPSCs中非常常见，但其性质取决于供体细胞的性别及其对培养条件的响应。雌性iPSCs中的印记抵抗重编程过程中初始的全基因组DNA去甲基化波，但最终细胞会积累低甲基化缺陷，与培养基配方无关。相比之下，雄性iPSCs上的印记缺陷取决于实验条件，并在重编程过程中出现，可通过添加维生素C（VitC）来减轻。我们的发现对于进一步优化重编程策略和生成具有稳定表观基因组的iPSCs至关重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 小鼠iPSCs中基因组印记缺陷是否取决于供体细胞性别和重编程培养基配方，以及这些缺陷在重编程和分化过程中的动态变化。
- 核心机制
- 雌性iPSCs中印记低甲基化缺陷与重编程过程中全基因组DNA去甲基化波解偶联，但最终被动丢失甲基化；雄性FBS-iPSCs中印记缺陷在重编程期间出现，涉及Dlk1-Dio3和Igf2-H19位点的从头超甲基化，可能通过TET双加氧酶活性受培养基条件影响。
- 主要证据
- 利用IMPLICON在多种雌雄iPSC系中检测印记甲基化，结合RNA-seq等位基因表达分析、LC-MS/MS检测全局5mC/5hmC、焦磷酸测序检测重复元件，以及重编程中间体和分化后的NPC验证；雌性iPSCs普遍低甲基化，雄性FBS-iPSCs超甲基化，维生素C部分纠正Dlk1-Dio3超甲基化。
- 研究意义
- 研究结果有助于进一步优化重编程策略，生成具有稳定表观基因组的iPSCs，并提示在人类iPSC应用中应将印记保真度纳入质量控制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
IMPLICON分析印记甲基化
检测iPSCs中印记控制区（ICR）的等位基因特异性DNA甲基化状态。
对13个印记簇及对照区域进行亚硫酸氢盐处理后的扩增子高通量测序，结合去重步骤，以单分子分辨率分析亲本等位基因的甲基化水平。
分析印记基因等位基因表达
验证ICR甲基化缺陷是否导致印记基因单等位表达丧失。
利用RNA-seq数据和SNP信息分析17个印记基因的等位基因特异性表达，并用RT-PCR结合Sanger测序验证H19和Snrpn等基因。
比较不同培养基和性别的影响
探究KSR、FBS、KSR/FBS和FBS+VitC培养基对雌雄iPSCs印记保真度的影响。
在四种培养基条件下生成iPSC系，用IMPLICON检测印记甲基化，并分析全局5mC/5hmC水平及重复元件甲基化。
追踪重编程过程中印记缺陷的出现
确定印记缺陷是在重编程的哪个阶段产生，以及是否与全局DNA去甲基化相关。
在第12天和第24天通过FACS分选THY1-/SSEA1+重编程中间体和THY1+/SSEA1-非重编程细胞，用IMPLICON和LC-MS/MS分析印记甲基化和全局5mC/5hmC。
测试维生素C对雄性iPSCs印记缺陷的纠正作用
评估添加维生素C能否减轻雄性FBS-iPSCs中Dlk1-Dio3等位点的超甲基化。
在FBS培养基中添加0.5 µM维生素C进行重编程，用IMPLICON分析印记甲基化，并通过单细胞克隆分离和Meg3表达分析验证。
验证印记缺陷在分化后的维持
确定印记缺陷是否在iPSC分化为神经祖细胞（NPCs）后持续存在。
将F FBS5和M FBS5 iPSCs分化为NPCs，用IMPLICON检测印记甲基化，并分析印记基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| MEFs generation | 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 |
| 胰蛋白酶-EDTA 1X | Gibco | 25300-062 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Gibco | 10569-010 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050-061 | |
| Reprogramming | 多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 |
| 0.05%胰蛋白酶-EDTA 1X | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Stem cell culture | 敲除血清替代物 | Gibco | 10828-028 |
| 白血病抑制因子 | Millipore | ESG1107 | |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | 11140-050 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco | 31350-010 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 16141-079 | |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| 抗坏血酸 | Sigma | A4544 | |
| FACS | PE抗小鼠CD90.2/Thy1.2抗体 | Biolegend | 105307 |
| Brilliant Violet 421抗小鼠CD15/SSEA-1抗体 | Biolegend | 125613 | |
| Immunofluorescence | OCT4抗体（克隆7F9.2） | Merck Millipore | MAB4419 |
| SSEA-1抗体（克隆MC-480） | Merck Millipore | MAB4301 | |
| NANOG抗体 | Reprocell | RCAB002P-F | |
| Cy3亲和纯化F(ab’)2片段山羊抗小鼠IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-166-003 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Karyotyping | 秋水仙胺 | ThermoFisher | 15212-012 |
| DNA extraction and bisulfite treatment | EZ DNA甲基化金试剂盒 | Zymo Research | D5006 |
| LC-MS/MS | DNA降解酶Plus | Zymo Research | E2020 |
| 2′-脱氧胞苷-13C1,15N2 | Santa Cruz | SC-214045 | |
| 5-（甲基-2H3）-2′-脱氧胞苷 | Santa Cruz | SC-217100 | |
| 5-（羟甲基）-2′-脱氧胞苷-2H3 | Toronto Research Chemicals | H946632 | |
| Bisulfite pyrosequencing | KAPA HiFi HotStart 2X预混液 | Roche | KK2802 |
| IMPLICON library preparation | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63880 |
| RNA extraction | NZYOL RNA分离试剂 | NZYTech | MB18501 |
| DNase I | Roche | 04716728001 | |
| RT-qPCR | Transcriptor高保真cDNA合成试剂盒 | Roche | 05081963001 |
| iTaq SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1725124 | |
| RT-PCR | NZYGelpure试剂盒 | Nzytech | MB01102 |
| NPC differentiation | DMEM/F12培养基 | Thermofisher | 31330-038 |
| Neurobasal培养基 | Thermofisher | 21103-049 | |
| L-谷氨酰胺 | Thermofisher | 25030-024 | |
| B27添加剂 | Thermofisher | 17504-044 | |
| N2添加剂 | Millipore | SCM012 | |
| 表皮生长因子 | Peprotech | 315-09 | |
| 成纤维细胞生长因子2 | Peprotech | 100-18B |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重编程与iPSC系建立 | DOX浓度1.5 µg/ml，诱导12天；挑克隆时间第12天；扩增至约第50天；KSR-iPSCs雌雄各6个克隆，FBS-iPSCs雌雄各5个克隆。 阅读提示：Methods中的Reprogramming of MEFs和Stem cell culture conditions小节，以及Fig. 1A和Fig. 4A图注。 |
| 印记甲基化检测（IMPLICON） | 检测13个印记簇及对照区域；亚硫酸氢盐转化使用EZ DNA methylation Gold kit；测序平台Illumina MiSeq，paired-end 250 bp；数据分析使用IMPLICON流程。 阅读提示：Methods中的IMPLICON library preparation and analysis小节，以及Supplementary Tables 2和3。 |
| 重编程中间体分选 | FACS抗体：PE anti-mouse CD90.2/Thy1.2（1:100）和Brilliant Violet 421 anti-mouse CD15/SSEA-1（1:200）；分选时间点day 12和day 24；分选后纯度检查。 阅读提示：Methods中的Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) during reprogramming小节，以及Supplementary Fig. 10。 |
| 维生素C处理 | 维生素C浓度0.5 µM，添加至FBS培养基；FBS+VitC-iPSCs生成6个克隆。 阅读提示：Methods中的Stem cell culture conditions小节，以及Fig. 7图注。 |
| 畸胎瘤实验 | 细胞数量2×10^6，皮下注射NSG小鼠；每个细胞系2个畸胎瘤；H&E染色分析三胚层。 阅读提示：Methods中的Teratoma assay小节，以及Fig. 1D图注。 |
| 全局5mC/5hmC检测 | LC-MS/MS使用Q-Exactive质谱仪；DNA消化使用DNA Degradase Plus；同位素内标；六点标准曲线。 阅读提示：Methods中的5mC/5hmC measurements by liquid chromatography-mass spectrometry小节。 |