全基因组CRISPR/Cas9筛选线粒体自噬诱导因子
鉴定敲除后能诱导线粒体自噬的基因，以发现不依赖去极化的线粒体自噬诱导通路。
在表达PARKIN和mt-mKEIMA的HeLa FlpIn TRex细胞中转导Brunello文库（每个基因4条gRNA，覆盖19,144个基因），通过流式分选线粒体自噬阳性细胞，并进行下一代测序鉴定富集基因。
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蛋白质输入马达复合体对线粒体错误折叠的响应：减少蛋白质输入并激活线粒体自噬
Protein import motor complex reacts to mitochondrial misfolding by reducing protein import and activating mitophagy.
实验完整度
高全基因组CRISPR筛选、细胞模型、线虫模型、蛋白质组学、邻近标记互作组学及功能验证等多层级证据
主要模型
HeLa FlpIn TRex细胞（表达PARKIN和mt-mKEIMA报告基因） HEK293细胞 秀丽隐杆线虫（C. elegans）
重点核对
HSPA9或GrpEL1敲除后mt-mKEIMA流式检测线粒体自噬流 HSPA9敲低后MTS-EGFP线粒体定位及TMRE膜电位检测 PAM组分RNAi后线虫LGG-1::mCherry与SIR2.2::GFP共定位 脉冲SILAC蛋白质组学定量线粒体蛋白输入速率 TIMM44-TurboID邻近标记互作组学检测PAM与TIM相互作用
摘要
线粒体自噬对维持线粒体功能和预防疾病至关重要。它在线粒体去极化时被激活，导致PINK1稳定在线粒体外膜上。引人注目的是，包括线粒体蛋白质错误折叠在内的多种条件可以在不丧失膜电位的情况下诱导线粒体自噬。其潜在的分子细节仍不清楚。在这里，我们报道由前序列转位酶相关马达复合体PAM介导的线粒体蛋白质输入丧失足以在极化线粒体中诱导线粒体自噬。一项针对线粒体自噬诱导因子的全基因组CRISPR/Cas9筛选鉴定了PAM复合体的组分。蛋白质输入缺陷能够在不需去极化的情况下诱导线粒体自噬。在线粒体蛋白质错误折叠时，PAM从输入机器上解离，导致蛋白质输入减少和线粒体自噬诱导。我们的发现扩展了当前的线粒体自噬模型，以解释在不影响膜极化的条件下（如线粒体蛋白质错误折叠）的线粒体自噬诱导。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 线粒体蛋白质错误折叠如何在不依赖膜电位去极化的情况下诱导线粒体自噬？
- 核心机制
- 线粒体蛋白质错误折叠导致PAM复合体组分（如TIMM44、HSPA9、GrpEL1/2）从TIM转位酶上解离并进入不溶性组分，从而减少线粒体蛋白质输入，稳定PINK1并激活PINK1/PARKIN依赖的线粒体自噬。
- 主要证据
- 全基因组CRISPR/Cas9筛选鉴定PAM组分为线粒体自噬诱导因子；HSPA9、PAM16或LONP1敲低及GTPP处理减少线粒体蛋白输入并诱导线粒体自噬而不伴随膜电位丧失；脉冲SILAC蛋白质组学显示蛋白输入减少；定量蛋白质组学显示PAM组分在错误折叠条件下不溶性增加；TurboID邻近标记显示TIMM44与TIM及PAM16相互作用丧失。
- 研究意义
- 研究扩展了当前线粒体自噬模型，解释了在不影响膜极化的条件下（如线粒体蛋白质错误折叠）线粒体自噬诱导的机制，并将蛋白质折叠、输入和线粒体自噬机制与神经退行性疾病联系起来。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PAM复合体组分的线粒体自噬诱导功能
验证筛选到的PAM复合体组分（HSPA9、GrpEL1）敲除后能否诱导线粒体自噬，并检测该功能在进化上的保守性。
使用两条gRNA分别敲除HSPA9或GrpEL1，通过流式细胞术检测mt-mKEIMA线粒体自噬流；在秀丽隐杆线虫中通过RNAi敲低PAM组分，检测LGG-1::mCherry与SIR2.2::GFP共定位。
检测蛋白质输入缺陷对线粒体自噬和膜电位的影响
验证PAM功能丧失导致的蛋白质输入缺陷是否足以诱导线粒体自噬，以及是否伴随膜电位去极化。
通过HSPA9 siRNA处理HeLa FlpIn TRex细胞，检测MTS-EGFP线粒体定位、PINK1累积、mt-mKEIMA线粒体自噬流和TMRE膜电位；使用oligomycin和deferiprone处理细胞，通过脉冲SILAC蛋白质组学定量蛋白质输入，并检测线粒体自噬和膜电位。
验证线粒体蛋白质错误折叠通过减少蛋白质输入诱导线粒体自噬
验证线粒体蛋白质错误折叠（药理学或遗传学诱导）是否通过减少蛋白质输入诱导线粒体自噬。
使用GTPP处理或LONP1 siRNA敲低诱导蛋白质错误折叠，通过脉冲SILAC检测蛋白质输入，通过mt-mKEIMA检测线粒体自噬，通过TMRE检测膜电位，并检测PINK1累积和PINK1依赖性。
分析蛋白质错误折叠对PAM复合体溶解性和相互作用的影响
探究蛋白质错误折叠如何导致蛋白质输入缺陷，明确PAM复合体在错误折叠条件下的变化。
通过GTPP或LONP1 siRNA诱导错误折叠，分离线粒体不溶性组分并进行定量蛋白质组学分析，检测PAM组分在可溶/不溶组分的分布；通过TIMM44-TurboID邻近标记检测TIMM44与TIM及PAM16的相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | GIBCO | 21875034 |
| 胎牛血清 | GIBCO | 10270-106 | |
| 杀稻瘟菌素 | Invitrogen | -- | |
| 博来霉素 | Invitrogen | -- | |
| 潮霉素B | Invitrogen | -- | |
| 嘌呤霉素 | Sigma | P8833 | |
| 聚凝胺 | Merck Millipore | TR-1003 | |
| RNAiMAX转染试剂 | Thermo Scientific | 13778150 | |
| Lipofectamine2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| 慢病毒生产 | Opti-MEM I培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 |
| pPAX1包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| CRISPR筛选 | 人类Brunello CRISPR敲除文库 | Addgene | 73178 |
| 基因组DNA提取 | GeneJet DNA纯化试剂盒 | Thermo Scientific | K0721 |
| 下一代测序 | NEBNext高保真2×PCR预混液 | New England Biolabs | M0541 |
| QIAquick凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28706 | |
| Illumina NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| 线粒体蛋白输入检测 | Mitotracker深红色FM染料 | Cell Signaling | 8778 |
| 膜电位检测 | 四甲基罗丹明乙酯 | -- | -- |
| 线粒体分离 | cOmplete无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836170001 |
| PhosStop磷酸酶抑制剂 | Roche | 4906837001 | |
| 脉冲SILAC | SILAC用RPMI160培养基 | GIBCO | 88365 |
| Arg10（13C6,15N4-L-精氨酸） | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| Lys8（13C6,15N2-L-赖氨酸） | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| 蛋白质组学样品制备 | BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23225 |
| LysC蛋白酶 | Wako Chemicals | -- | |
| 胰蛋白酶 | Promega | -- | |
| TMT11标记试剂 | Thermo Scientific | A34808 | |
| Pierce高pH反相肽段分级试剂盒 | Thermo Scientific | 84868 | |
| 邻近标记 | TurboID生物素连接酶 | -- | -- |
| 生物素 | -- | -- | |
| 质谱分析 | QExactive HF质谱仪 | ThermoFisher Scientific | -- |
| Easy nLC 1200液相色谱仪 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 免疫印迹 | Bolt Bis-Tris Plus凝胶 | Thermo Scientific | -- |
| Intercept封闭液 | LI-COR Biosciences | 927-70001 | |
| Odyssey CLx成像仪 | LI-COR | -- | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | SantaCruz | sc69879 | |
| 抗GrpEL1抗体 | Proteintech | 12720-1-AP | |
| 抗HSP60抗体 | Abcam | ab4679 | |
| 抗HSPA9抗体 | Abcam | ab2799 | |
| 抗LONP1抗体 | Proteintech | 15440-1-AP | |
| 抗PAM16抗体 | Proteintech | 15321-1-AP | |
| 抗磷酸化(S65)泛素抗体 | Boston Biochem | A110 | |
| 抗PINK1抗体 | CST | 6946 | |
| 抗TIMM23抗体 | Proteintech | 11123-1-AP | |
| 抗TIMM44抗体 | Proteintech | 13859-1-AP | |
| 抗TOMM20抗体 | SantaCruz | sc17764 | |
| 抗TOMM40抗体 | SantaCruz | sc 365467 | |
| 抗小鼠IgG-680RD二抗 | Li-Cor | 926-68072 | |
| 抗小鼠IgG-800CW二抗 | Li-Cor | 926-32210 | |
| 抗兔IgG-680二抗 | Li-Cor | 926-68073 | |
| 抗兔IgG-800CW二抗 | Li-Cor | 926-32213 | |
| 流式细胞术 | BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- |
| BD FACSymphony A5流式细胞仪 | BD | -- | |
| BD FACSAria III细胞分选仪 | BD | -- | |
| 活细胞成像 | Yokogawa CQ-1活细胞成像系统 | Yokogawa | -- |
| 线虫成像 | VisiScope转盘共聚焦显微镜系统 | Visitron Systems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 全基因组CRISPR/Cas9筛选 | 文库（Human Brunello CRISPR knock-out pooled library）、MOI（0.2）、细胞数量（4×10^6，覆盖率100×）、转导后培养时间（8天分选）、阳性门控设置（mt-mKEIMA 561/405 nm比值升高） 阅读提示：Methods“CRISPR mitophagy screen”小节及Figure 1a |
| mt-mKEIMA线粒体自噬流检测 | 细胞系（HeLa FlpIn TRex mt-mKEIMA PARKIN）、doxycycline浓度（0.25 µg/ml）和处理时间（15小时）、流式细胞仪门控策略、激发/发射波长设置 阅读提示：Methods“Mitophagy flux mt-mKEIMA assay”小节及Supplementary Fig. 5a |
| TMRE膜电位检测 | TMRE浓度（200 nM）、染色时间（30分钟，37°C）、流式细胞仪门控（至少10,000个细胞）、去极化对照（CCCP处理） 阅读提示：Methods“Membrane potential measurements”小节及Supplementary Fig. 5b |
| 脉冲SILAC蛋白质组学检测蛋白质输入 | SILAC重标培养基成分（Arg10、Lys8）、标记时间（最后2小时）、线粒体分离方法、质谱仪器参数 阅读提示：Methods“Organelle-specific pulsed-SILAC MS sample preparation”及“Mass spectrometry”小节 |
| TurboID邻近标记 | 细胞系（HeLa FlpIn TIMM44-TurboID）、doxycycline诱导浓度（0.25 µg/ml）和时间（24小时）、生物素浓度（0.5 mM）和标记时间（20分钟） 阅读提示：Methods“TurboID proximity biotinylation”小节及Figure 4d |