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        TrkB激动剂前药通过抑制天冬酰胺内肽酶并增加骨保护素预防骨丢失

        A TrkB agonist prodrug prevents bone loss via inhibiting asparagine endopeptidase and increasing osteoprotegerin.

        作者信息Jing Xiong, Jianming Liao, Xia Liu, Zhaohui Zhang, Jonathan Adams, Roberto Pacifici, Keqiang Ye
        PMID35973996
        期刊Nat Commun
        发布时间2022-08-16
        DOI10.1038/s41467-022-32435-5
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        含AEP KO/BDNF+/−小鼠OVX模型、μCT与骨组织形态计量、MC3T3-E1和RAW264.7体外功能验证及机制验证

        主要模型

        AEP敲除与野生型小鼠卵巢切除模型 BDNF+/−与野生型小鼠卵巢切除模型 MC3T3-E1成骨细胞分化模型 RAW264.7破骨细胞分化模型

        重点核对

        R13口服剂量21.8 mg/kg，每周6天，持续8周，溶于5% DMSO/0.5%甲基纤维素 OVX术后4天开始R13给药；抗RANK-L抗体10 mg/kg每周两次皮下注射，OVX后4周开始持续4周 MC3T3-E1处理：BDNF 50 ng/ml或7,8-DHF 0.5 μM，±K252a 100 nM预处理；OIM含地塞米松10^-7 M、β-甘油磷酸10 mM、抗坏血酸50 μg/ml RAW264.7破骨诱导：RANKL 30 ng/ml，处理5天（TRAP染色） 主要终点：μCT小梁骨参数（BV/TV、Conn.D、SMI、Tb.N、Tb.Sp、Tb.Th）、血清 osteocalcin/CTX/RANKL/OPG、TRAP染色与钙黄绿素双标组织形态计量

        摘要

        脑源性神经营养因子（BDNF）及其原肌球蛋白相关激酶B受体（TrkB）在人成骨细胞中表达并介导骨折愈合。BDNF/TrkB信号激活Akt，Akt磷酸化并抑制天冬酰胺内肽酶（AEP），AEP调节人骨髓基质细胞（hBMSC）的分化命运，并在绝经后骨质疏松中发生改变。本文中我们展示R13——一种小分子TrkB受体激动剂前药——抑制AEP并促进骨形成。尽管卵巢切除（OVX）诱导的核因子κB配体受体激活因子（RANK-L）和骨保护素（OPG）在WT和BDNF+/−小鼠之间保持相当，但R13处理显著升高两种小鼠的OPG而不改变RANKL，阻断小梁骨丢失。引人注目的是，R13和抗RANK-L表现出等同的治疗效果。此外，OVX增加WT和AEP KO小鼠的RANK-L和OPG，且后者RANK-L/OPG比值低于前者，减弱骨转换。R13释放的7,8-DHF激活TrkB及其下游效应器CREB，CREB对OPG升高至关重要。因此，7,8-DHF抑制C/EBPβ/AEP通路，抑制RANK-L诱导的RAW264.7破骨细胞生成。因此，我们的发现支持R13通过抑制AEP和升高OPG发挥其对骨质疏松的治疗效果。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        BDNF模拟物R13是否通过抑制AEP并促进骨形成来阻断卵巢切除诱导的骨丢失。
        核心机制
        R13释放的7,8-DHF激活TrkB，经Akt磷酸化AEP T322并抑制AEP活性，同时通过CREB上调OPG，降低RANK-L/OPG比值，从而促进成骨并抑制破骨生成。
        主要证据
        AEP KO小鼠OVX后小梁骨密度高于WT且RANKL/OPG比值更低；R13在WT和BDNF+/− OVX小鼠中升高OPG、降低RANKL/OPG并阻断小梁骨丢失；MC3T3-E1中7,8-DHF经TrkB/CREB上调OPG并抑制C/EBPβ/AEP，RAW264.7中抑制RANK-L诱导的破骨生成。
        研究意义
        提示R13通过抑制AEP和升高OPG发挥抗骨质疏松疗效，其效果与抗RANK-L抗体相当。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        AEP敲除对OVX骨丢失的影响

        验证AEP在OVX诱导骨丢失中的作用。

        对AEP KO与WT同窝小鼠在12周龄行OVX或假手术，取股骨行μCT、H&E、TRAP染色、钙黄绿素双标及血清骨转换标志物检测。

        2

        R13对OVX骨丢失的体内保护作用

        验证R13是否阻断OVX诱导的骨丢失并调节OPG/RANK-L。

        WT与BDNF+/−小鼠OVX后4天口服R13或溶剂，8周后行μCT、H&E、TRAP染色、钙黄绿素双标及血清标志物检测；另设抗RANK-L抗体对照。

        3

        7,8-DHF对成骨细胞分化与OPG分泌的影响

        验证7,8-DHF是否经TrkB促进成骨分化、矿化及OPG表达。

        MC3T3-E1在OIM中给予BDNF或7,8-DHF±K252a，行ALP染色、茜素红染色、Western blot、AEP活性测定、qPCR与ELISA。

        4

        CREB对7,8-DHF诱导OPG表达的介导作用

        确定7,8-DHF上调OPG所依赖的转录因子。

        在MC3T3-E1中敲低CREB、c-Jun或C/EBPβ，检测OPG与RANK-L蛋白/mRNA及RANK-L/OPG比值。

        5

        7,8-DHF对破骨细胞生成的抑制作用

        验证7,8-DHF是否抑制RANK-L诱导的破骨细胞生成。

        RAW264.7在RANKL存在下给予BDNF或7,8-DHF，TRAP染色计数多核破骨细胞，Western blot检测C/EBPβ/AEP。

        6

        R13与抗RANK-L抗体的疗效比较

        比较R13与抗RANK-L抗体对OVX骨丢失的疗效。

        WT小鼠OVX后4周给予IgG、抗RANK-L抗体或R13，4周后行μCT、H&E、TRAP染色、钙黄绿素双标及血清标志物检测。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        微型计算机断层扫描苏木精-伊红染色抗酒石酸酸性磷酸酶染色钙黄绿素双荧光标记骨组织形态计量
        验证细胞功能变化
        碱性磷酸酶染色茜素红S染色碱性磷酸酶活性测定
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹实时定量PCR酶联免疫吸附测定
        验证机制链路
        AEP活性测定siRNA敲低质粒转染
        评估体内效果
        卵巢切除模型药代动力学分析液相色谱-串联质谱
        数据分析与统计
        单因素方差分析Student t检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养α-MEM培养基GibcoA1049001
        Lipo3000转染试剂InvitrogenL3000008
        细胞处理K252aAbcamab120419
        ALP/TRAP染色TRACP&ALP双染试剂盒Takara BioMK300
        ALP活性检测碱性磷酸酶检测试剂盒Abcamab83369
        AEP活性检测Z-Ala-Ala-Asn-AMC底物Bachem4033201
        ELISA血清骨钙素ELISA试剂盒Novus biologicalsNBP2-68151
        CTX ELISA试剂盒Immunodiagnostic systemsAC-06F1
        RANKL ELISA试剂盒Abcamab269553
        OPG ELISA试剂盒Abcamab203365
        Western blot抗C/EBPβ（HT-7）抗体Santa Cruzsc-7962
        抗RANKL抗体Santa Cruzsc-377079
        抗OPG抗体Santa Cruzsc-390518
        抗osterix抗体Santa Cruzsc-393325
        抗RUNX2抗体Santa Cruzsc-101145
        抗Legumain（D6S4H）抗体Cell Signaling Technology93627
        抗p-C/EBPβ抗体Cell Signaling Technology3084s
        抗Akt抗体Cell Signaling Technology4691s
        抗p-Akt(S473)抗体Cell Signaling Technology9271s
        抗MAPK抗体Cell Signaling Technology9102s
        抗p-MAPK抗体Cell Signaling Technology9106s
        抗p-c-Jun（Ser73）抗体Cell Signaling Technology3270T
        抗c-Jun抗体Cell Signaling Technology9165T
        抗CREB抗体Cell Signaling Technology9197T
        抗p-CREB抗体Cell Signaling Technology9198T
        抗TrkB抗体R&D SystemMAB397
        抗β-actin抗体Sigma-AldrichA5316
        抗纤连蛋白抗体Sigma-AldrichF3648
        抗小鼠IgG-HRPCell Signaling Technology70765
        抗兔IgG-HRPCell Signaling Technology70745
        动物实验抗RANKL单克隆抗体Ichorbio510012
        抗IgG抗体Ichorbio401412
        分子生物学EZ-Link Sulfo-NHS-LC生物素化试剂盒Thermo Fisher21435

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        R13体内给药
        R13剂量21.8 mg/kg、溶剂5% DMSO/0.5%甲基纤维素、给药频率每周6天、持续8周、口服灌胃；OVX后4天开始给药
        阅读提示：Methods Animals段落及Fig. 3图注
        抗RANK-L抗体对照
        抗RANK-L单克隆抗体10 mg/kg、每周两次、皮下注射、OVX后4周开始持续4周；对照IgG
        阅读提示：Methods Animals段落及Fig. 7、Fig. 8图注
        MC3T3-E1成骨分化处理
        OIM成分（地塞米松10^-7 M、β-甘油磷酸10 mM、抗坏血酸50 μg/ml）；BDNF 50 ng/ml或7,8-DHF 0.5 μM；K252a 100 nM预处理；ALP染色14天、茜素红21天、Western/qPCR 4天
        阅读提示：Methods Osteogenic differentiation、ALP staining、Alizarin Red S staining段落及Fig. 5、Fig. 6图注
        RAW264.7破骨分化处理
        RANKL 30 ng/ml；BDNF 50 ng/ml或7,8-DHF 0.5 μM；处理5天（TRAP染色）
        阅读提示：Methods Osteoclast differentiation、TRAP staining段落及Supplementary Fig. 6
        体内药代动力学
        R13 21.8 mg/kg口服；取样时间点0、15、30、60、120 min；3只/组；检测LC-MS/MS
        阅读提示：Methods In vivo PK of 7,8-DHF段落及Supplementary Fig. 2

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