INDUCE-seq方法建立与验证
验证无PCR的INDUCE-seq文库制备能否数字化检测DSB。
在固定透化细胞中连接全长化学修饰P5接头至末端修复的DSB，提取基因组DNA片段化后连接半功能P7接头，通过Illumina流动池富集并测序。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
INDUCE-seq：内源性和诱导性基因组DNA断裂的精准数字化定位
Precision digital mapping of endogenous and induced genomic DNA breaks by INDUCE-seq.
实验完整度
高包含HEK293T、DIvA细胞系体外模型，多种诱导断裂检测及CRISPR编辑功能验证，并与多种方法比较。
主要模型
HEK293T细胞（HindIII诱导DSB） U2OS DIvA细胞（4OHT诱导AsiSI） HEK293细胞（CRISPR-Cas9 EMX1编辑）
重点核对
HEK293T细胞经HindIII-HF®（50U，37°C，18h）诱导DSB，检测~25,000个细胞，~148M reads，平均~5900 breaks/细胞 DIvA细胞经300 nM 4OHT处理4h诱导AsiSI，检测232个AsiSI位点，400,000细胞中检测到单次切割位点 HEK293细胞核转染224 pmol RNP/3.5×10^5细胞，在0、7、12、24、30h收集，两个独立生物学重复 EMX1 sgRNA序列GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA，Cas9蛋白含N端6xHN标签 扩增子测序（rhAmpSeq）检测indel频率，灵敏度0.1%，验证60个off-target中4个
摘要
理解DNA双链断裂（DSB）在基因组中如何形成和修复，依赖于对其频率和位置的准确测量。这对于识别化学物质的DNA损伤潜力以及包括基因组编辑技术在内的疗法的安全开发至关重要。当前的DSB测序方法存在背景水平高、无法准确测量低频内源性断裂以及测序成本高等问题。在此，我们描述了INDUCE-seq，它克服了这些问题，可同时检测由生理过程引起的低水平内源性DSB以及由限制性内切酶或CRISPR-Cas核酸酶诱导的较高水平复发性断裂。INDUCE-seq利用了一种创新的NGS流动池富集方法，允许对断裂进行数字化检测。因此，它可用于确定DSB修复机制并促进治疗性基因组编辑的安全开发。我们进一步讨论了该方法如何被调整以检测其他基因组特征。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何准确测量基因组中低频内源性DNA双链断裂和诱导性DSB的频率和位置，以克服现有测序方法的背景高、成本高和偏差问题。
- 核心机制
- INDUCE-seq通过两阶段无PCR的文库制备，在Illumina流动池上富集标记的DSB末端，使每个测序read对应一个原始细胞中的标记DSB末端，实现数字化检测。
- 主要证据
- 在HEK293T细胞中同时检测HindIII诱导的高频DSB和低频内源性DSB，动态范围达三个数量级；在DIvA细胞中检测AsiSI诱导的DSB，灵敏度高于DSBCapture和BLISS；在CRISPR-Cas9编辑的HEK293细胞中检测EMX1 on-target和60个off-target，优于现有方法。
- 研究意义
- INDUCE-seq可用于DSB修复机制研究，并促进治疗性基因组编辑的安全性评估和合成guide RNA设计，还可适配检测其他基因组特征。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
限制性内切酶诱导DSB检测
评估INDUCE-seq检测高频诱导DSB和低频内源性DSB的灵敏度与动态范围。
在交联HEK293T细胞中用HindIII-HF®诱导DSB，制备INDUCE-seq文库并测序，分析HindIII位点和内源性断裂。
活细胞中AsiSI诱导DSB检测
验证INDUCE-seq在活细胞中检测诱导DSB的能力并与BLISS和DSBCapture比较。
用4OHT处理DIvA细胞诱导AsiSI切割，制备INDUCE-seq文库，检测AsiSI位点并计算断裂频率。
CRISPR-Cas9诱导DSB检测与off-target发现
应用INDUCE-seq检测CRISPR-Cas9 EMX1编辑的on-target和off-target DSB，并分析动力学。
HEK293细胞核转染EMX1 RNP，在0、7、12、24、30h收集，制备INDUCE-seq文库，使用序列基于的off-target发现流程分析。
扩增子测序验证突变结果
测量INDUCE-seq检测到的on-target和off-target位点的编辑结果。
使用rhAmpSeq引物对INDUCE-seq鉴定的off-target进行扩增子测序，CRISPResso分析indel频率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
检测DNA双链断裂
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | Life Technologies | -- | |
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma | H7904 | |
| 核转染 | Lonza 4D-Nucleofector X单元 | Lonza | -- |
| 细胞固定 | 多聚-D-赖氨酸预包被96孔板 | Greiner bio-one | 655940 |
| INDUCE-seq | CutSmart®缓冲液 | NEB | B7204S |
| 快速末端修复试剂盒 | NEB | E1201L | |
| NEBNext® dA加尾模块 | NEB | E6053L | |
| T4 DNA连接酶缓冲液 | NEB | B0202S | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202M | |
| 蛋白酶K | Invitrogen | AM2584 | |
| 基因组DNA纯化浓缩试剂盒 | Zymo Research | D4010 | |
| Qubit DNA高灵敏度检测试剂盒 | Invitrogen | Q32854 | |
| SPRI磁珠 | GC Biotech | CNGS-0005 | |
| NEBNext® Ultra™ II DNA模块 | NEB | E7546L | |
| NEBNext® Ultra™ II连接模块 | NEB | E7595L | |
| KAPA Illumina®平台文库定量试剂盒 | Roche | 07960255001 | |
| HindIII-HF®限制性内切酶 | NEB | R3104S | |
| 扩增子测序 | rhAmpSeq HotStart预混液1 | IDT | -- |
| rhAmpSeq HotStart预混液2 | IDT | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 限制性内切酶诱导DSB检测 | HEK293T细胞数量（~25,000个细胞用于文库）、HindIII-HF®剂量（50U）、消化时间（37°C，18h）、分析阈值（≥5 breaks/位点） 阅读提示：Methods中‘In situ DSB induction with HindIII’和‘HindIII-induced DSB analysis in HEK293T cells’ |
| 活细胞AsiSI诱导DSB检测 | DIvA细胞数量（400,000个细胞）、4OHT浓度（300 nM）和处理时间（4h）、AsiSI位点分析（1211个，不允许错配） 阅读提示：Methods中‘Cell culture and treatment’和‘AsiSI-induced DSB detection and analysis in DIvA cells’ |
| CRISPR-Cas9诱导DSB检测 | HEK293细胞数量（3.5×10^5个细胞）、RNP量（224 pmol）、sgRNA序列、核转染脉冲代码（CM-130）、时间点（0、7、12、24、30h）、生物学重复（两个独立重复） 阅读提示：Methods中‘Cell culture and treatment’和‘Cas9 protein and sgRNA’ |
| off-target发现与过滤 | Cas-OFFinder错配参数（最多6或7个错配，种子区最多2-5个错配）、32种过滤条件的选择（条件7用于EMX1）、FDR计算 阅读提示：Methods中‘CRISPR off-target analysis pipeline’和Results中‘Detection of CRISPR-Cas9 genome-editing induced breaks’ |
| 扩增子测序验证 | 基因组DNA量（10 ng）、引物设计（rhAmpSeq）、测序平台（Illumina NextSeq 550 Mid Output，2x150 bp）、indel分析软件（CRISPResso v2.0.32） 阅读提示：Methods中‘Amplicon-seq validation of mutational outcome’ |