CDK2/Cyclin A界面可成药性预测与虚拟筛选
判断CDK2与Cyclin A PPI界面是否可成药并筛选潜在小分子
基于CDK2/Cyclin A复合物（PDB 1FIN）用CavityPlus进行口袋检测；用LIVS流程对1925种FDA批准药物进行计算机筛选，选出10个候选化合物。
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抑制CDK2与Cyclin A复合物导致癌细胞中CDK2的自噬性降解
Inhibition of the CDK2 and Cyclin A complex leads to autophagic degradation of CDK2 in cancer cells.
实验完整度
高含计算机筛选、体外结合与突变验证、细胞功能、小鼠移植瘤与骨髓移植模型及患者原代细胞多层级验证
主要模型
THP1白血病细胞系及CDK2敲除/突变株 HEK293与293T细胞 NSG小鼠THP1异种移植模型 MLL-AF9骨髓移植白血病小鼠模型 人原代AML患者单个核细胞
重点核对
HHT处理剂量与时间：THP1细胞40 ng/mL处理12小时或不同时间；DARTS中HHT 0、1、10、100 μg/mL CDK2结合位点突变：T47A、R50A、R150A（CDK2-3As）及CDK2-5Rs、CDK2-Δ171-243 自噬通路验证：NH4Cl 20 mM、氯喹50 μM、MG132 5 μM、lactacystin 10 μM预处理加HHT 9小时 Trim21验证：Trim21-HA或Trim21-ΔC过表达、Trim21 siRNA敲低 动物给药：THP1异种移植模型HHT 0.5 mg/kg腹腔注射每日一次；MLL-AF9模型HHT 1.0 mg/kg每日一次
摘要
细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）复合物在许多癌症中显著过度激活。虽然这使CDK2成为有吸引力的癌症治疗靶点，但大多数针对CDK2的抑制剂是ATP竞争性抑制剂，它们要么不具特异性，要么毒性很高，通常临床试验失败。一种替代方法是开发非ATP竞争性抑制剂；它们破坏CDK2与其伙伴或底物之间的相互作用，从而特异性抑制CDK2活性。在本报告中，我们鉴定了位于CDK2与Cyclin A之间蛋白质-蛋白质相互作用界面（PPI）上的两个潜在可成药口袋。为靶向这些潜在可成药口袋，我们对包含1925种FDA批准药物的文库进行了LIVS计算机筛选。使用该方法，高三尖杉酯碱（HHT）显示出对PPI的高亲和力，并强烈破坏CDK2与细胞周期蛋白之间的相互作用。进一步，我们证明HHT通过三联基序蛋白21（Trim21）在癌细胞中诱导CDK2蛋白的自噬性降解，并在白血病小鼠模型和人原代白血病细胞中得到证实。因此，这些结果鉴定了一种CDK2蛋白的自噬性降解机制，并为治疗CDK2依赖性癌症提供了潜在途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过靶向CDK2与Cyclin A的蛋白-蛋白相互作用界面来特异性抑制CDK2，并阐明其分子后果与降解机制。
- 核心机制
- HHT结合CDK2 PPI界面（依赖T47、R50、R150）破坏CDK2与Cyclin A/E相互作用，进而增强CDK2与Trim21结合，经自噬-溶酶体途径降解CDK2。
- 主要证据
- LIVS计算机筛选与DARTS/pulldown验证HHT直接结合CDK2；CDK2突变与Trim21突变/敲低实验证实结合位点及降解依赖；THP1异种移植与MLL-AF9小鼠模型及人原代AML细胞验证HHT降低CDK2并抑制白血病。
- 研究意义
- 鉴定了一种CDK2蛋白的自噬性降解机制，并为治疗CDK2依赖性癌症提供了潜在途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HHT与CDK2直接结合及结合位点验证
验证HHT是否直接结合CDK2及结合是否依赖ATP口袋
用DARTS、HHT偶联磁珠pulldown、竞争pulldown及CDK2点突变体（T47A/R50A/R150A）验证结合；用AAD程序预测结合模式。
HHT破坏CDK2与Cyclin相互作用并抑制激酶活性
验证HHT对CDK2复合物及下游底物磷酸化的影响
THP1细胞HHT处理后co-IP检测CDK2与Cyclin A/E相互作用，western blot检测Rb和Nucleolin磷酸化；体外CDK2激酶实验检测突变体活性。
CDK2在AML中的功能及HHT体内靶向验证
确定CDK2对白血病增殖的作用及HHT体内效应是否依赖CDK2
CRISPR-Cas9构建THP1 CDK2敲除株，回补CDK2-wt、CDK2-3As、CDK2-3As/T160E；NSG小鼠尾静脉接种表达荧光素酶的细胞，HHT或溶媒腹腔注射；另用MLL-AF9骨髓移植模型。
HHT诱导CDK2蛋白降解及降解途径鉴定
确认HHT是否降低CDK2蛋白稳定性并确定降解途径
CHX chase与HaloTag-TMR pulse-chase测定CDK2半衰期；用NH4Cl、氯喹、MG132、lactacystin及ATG7 siRNA判断自噬-溶酶体途径。
Trim21介导CDK2自噬性降解的机制验证
鉴定介导CDK2降解的自噬受体并验证相互作用界面
3xFLAG-CDK2 co-IP结合MS/MS鉴定候选；Trim21-HA/Trim21-ΔC、CDK2-5Rs及CDK2-Δ171-243突变体co-IP；荧光共定位；Trim21过表达与siRNA敲低检测CDK2降解。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DARTS | M-PER裂解缓冲液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | 23227 | |
| HHT磁珠合成 | Absolute Mag™环氧基磁珠 | CD Bioparticles | WHM-Q009 |
| CDK2激酶实验 | CDK2检测试剂盒 | BPS Bioscience | 79599 |
| 免疫沉淀 | FLAG免疫沉淀试剂盒 | Sigma | -- |
| 抗FLAG M2磁珠 | Sigma | -- | |
| HaloTag脉冲追踪 | HaloTag-四甲基罗丹明配体 | Promega | -- |
| 细胞存活检测 | CellTiter 96水溶性细胞增殖试剂盒 | Promega | -- |
| siRNA转染 | Nucleofector I电转仪 | Lonza | -- |
| Western blot | SuperSignal West Pico化学发光底物 | Thermo | -- |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| 实时PCR | RNeasy试剂盒 | QIAGEN | -- |
| SuperScript III逆转录酶试剂盒 | Life Technologies | -- | |
| SYBR Green实时PCR预混试剂盒 | Life Technologies | -- | |
| ABI-7500实时PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| nanoDSF | Prometheus NT.48仪器 | NanoTemper Technologies | -- |
| 多聚核糖体谱分析 | SuperaseIn RNA酶抑制剂 | Thermo Fisher | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| Beckman SW41 Ti转子 | Beckman | -- | |
| 体内成像 | IVIS 100生物发光/光学成像系统 | Xenogen | -- |
| D-荧光素 | Promega | -- | |
| Western blot | CDK2（E8J9T）XP兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 18048 |
| TRIM21多克隆抗体 | Proteintech | 12108-1-AP | |
| ATG7多克隆抗体 | Proteintech | 10088-2-AP | |
| HSP90多克隆抗体 | Proteintech | 13171-1-AP | |
| CDC37多克隆抗体 | Proteintech | 10218-1-AP | |
| Cyclin A2多克隆抗体 | Proteintech | 18202-1-AP | |
| Cyclin E1（D7T3U）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 20808 | |
| Nucleolin（D4C7O）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 14574 | |
| 抗磷酸化Nucleolin（T84）抗体 | Abcam | ab155977 | |
| Rb（4H1）小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9303 | |
| 抗磷酸化Rb（T821）抗体 | Abcam | ab4787 | |
| 单克隆抗FLAG M2抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗HaloTag抗体 | Promega | G9281 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 虚拟筛选与口袋预测 | PDB结构1FIN、CavityPlus cutoff平均pKd>6.5、LIVS筛选1925种FDA药物 阅读提示：Materials and methods中Druggability prediction与Virtual ligand screening and computational modeling |
| HHT与CDK2结合验证 | DARTS中HHT浓度0、1、10、100 μg/mL及pronase消化20分钟；竞争pulldown中Roscovitine 50 μM 阅读提示：Fig. 1C–1G及Materials and methods中DARTS与pulldown assay |
| CDK2复合物破坏与激酶活性 | THP1细胞HHT处理3小时或24小时；激酶实验Cyclin A2 20 ng、CDK2蛋白30 ng、HHT 100 ng/mL、30°C 45分钟 阅读提示：Fig. 1H、1I及Materials and methods中CDK2 kinase assay |
| CDK2敲除与回补细胞功能 | sgRNA靶向CDK2 exon1/exon2序列；回补CDK2-wt、CDK2-3As、CDK2-3As/T160E；每组四个独立生物学样本 阅读提示：Fig. 2C–2F及Materials and methods中CDK2 knockout by the CRISPR/Cas9 system |
| 体内白血病模型 | THP1细胞1×10^5尾静脉接种NSG雌鼠；HHT 0.5 mg/kg每日一次14天、休息2周再14天；MLL-AF9模型HHT 1.0 mg/kg每日一次 阅读提示：Fig. 2G、2H、Fig. 4及Materials and methods中AML xenograft model与Murine bone marrow transduction/transplantation model |
| CDK2降解途径 | CHX 50 μM、HHT 40 ng/mL；NH4Cl 20 mM、氯喹50 μM、MG132 5 μM、lactacystin 10 μM预处理2小时后HHT 9小时；ATG7 siRNA 阅读提示：Fig. 3B、Fig. 5C、5D及Materials and methods中Cycloheximide chase assay |
| Trim21介导降解 | Trim21-HA与Trim21-ΔC过表达；CDK2-5Rs（V154R/P155R/M233R/P234R/P238R）与CDK2-Δ171-243；HHT 40-50 ng/mL处理3、6或9小时 阅读提示：Fig. 5F–5L、Fig. 6及对应图注 |
| 人原代AML样本 | 6例不同AML亚型患者及1例健康供者单个核细胞；HHT处理浓度与时间 阅读提示：Fig. 4E–4G及Materials and methods中Peripheral blood mononuclear cells isolation |