原发AML与健康CD34+细胞的代谢组、蛋白组和转录组分析
解析AML与健康造血干/祖细胞之间的能量代谢差异
对原发AML CD34+样本与健康CD34+细胞进行定量蛋白组、转录组和基于LC-MS/MS的靶向代谢组分析，聚焦糖酵解、TCA循环和谷氨酰胺分解
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糖酵解守门人PDK1定义了人类急性髓系白血病不同遗传亚型之间的不同代谢状态
The Glycolytic Gatekeeper PDK1 defines different metabolic states between genetically distinct subtypes of human acute myeloid leukemia.
实验完整度
高包含原发AML患者样本多组学分析、8株AML细胞系、原发细胞体外功能实验及多种人源化小鼠异种移植体内验证
主要模型
原发AML患者CD34+细胞 健康CD34+造血干/祖细胞 AML细胞系（HL60、THP1、MOLM13、MV411、K562、NB4、KBM7） 人源化支架异种移植NSG小鼠模型
重点核对
PDK1high与PDK1low AML的分组依据及其与FLT3/NPM1突变状态的关联 Seahorse检测的OCR与ECAR基线水平及寡霉素A/FCCP/鱼霉素A+鱼藤酮注射条件 DAP处理浓度（10、20 μM）与处理时间（24 h至3天） shPDK1#1与shPDK1#2敲低序列及shLuc对照 体内DAP给药剂量与途径（15或20 mg/kg腹腔注射）及UPGL00004（3 mg/kg）
摘要
急性髓系白血病由于患者之间及患者内部存在强烈的遗传异质性而仍然难以治疗。在此，我们展示丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）在急性髓系白血病（AML）中作为不同代谢状态的可靶向决定因素。PDK1low的AML是OXPHOS驱动的，富集白血病粒-单核祖细胞（L-GMP）特征，并与FLT3-ITD和NPM1cyt突变相关。然而PDK1high的AML是OXPHOSlow的，FLT3和NPM1为野生型，并富集干性特征。代谢状态甚至可以在单个患者内遗传上不同的亚克隆之间有所不同。PDK1活性的丧失将糖酵解细胞释放到与ROS水平升高相关的OXPHOS状态，导致白血病细胞而非健康干/祖细胞的凋亡增强。这与谷氨酰胺摄取依赖性增强以及在人源化异种移植小鼠模型中体外和体内增殖减少相一致。我们表明，人类白血病表现出不同的代谢状态和适应机制，可以作为治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AML不同遗传亚型之间是否存在不同的代谢状态，以及PDK1是否可作为这些代谢状态的可靶向决定因素。
- 核心机制
- PDK1通过磷酸化并失活PDH作为糖酵解守门人；PDK1high AML呈OXPHOSlow和干性特征，抑制PDK1使细胞释放进入OXPHOS状态，伴随ROS升高、凋亡增强及对谷氨酰胺摄取的依赖性增加。
- 主要证据
- 原发AML患者样本的代谢组、蛋白组和转录组分析，Seahorse代谢检测，shRNA敲低与DAP抑制实验，原发细胞及细胞系的活力与凋亡检测，以及人源化支架异种移植和HL60、MV4-11、MOLM13移植小鼠模型的体内验证。
- 研究意义
- 人类白血病表现出不同的代谢状态和适应机制，可作为治疗靶点；PDK1抑制可使白血病细胞对谷氨酰胺酶抑制敏感，提示代谢重编程可被进一步临床利用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PDK1表达与代谢状态及遗传亚型的关联分析
确定PDK1表达与OXPHOS、干性特征及FLT3/NPM1突变状态的关系
利用蛋白组和TCGA转录组数据进行Pearson相关与GSEA分析，并用Seahorse检测OCR
单患者不同遗传亚克隆的代谢差异分析
验证代谢状态是否可在同一患者的不同亚克隆间不同
基于CD25表达分选CD34+/CD25+ FLT3-ITD亚克隆与CD34+/CD25− FLT3-wt亚克隆，进行ROS检测、RNAseq、GSEA和Western blot
AML细胞系代谢表型与PDK1功能验证
在细胞系中验证PDK1对糖酵解与OXPHOS的调控作用
对8株AML细胞系进行Seahorse检测，使用shPDK1#1、shPDK1#2敲低PDK1，检测ECAR、OCR、乳酸分泌和谷氨酰胺消耗
PDK1抑制剂DAP的体外与体内效果评估
评估药物抑制PDK1对AML细胞活力、凋亡和肿瘤生长的影响
用DAP处理AML细胞系和原发AML细胞，检测活力、凋亡、ROS和乳酸分泌；在人源化支架异种移植模型及HL60、MV4-11、MOLM13移植小鼠中评估体内效果
PDK1抑制与谷氨酰胺酶抑制的联合效应评估
检验PDK1抑制后细胞对谷氨酰胺分解的依赖性是否增强
在限谷氨酰胺条件下培养shPDK1细胞，联合使用DAP与CB-839或UPGL00004，并在HL60移植小鼠中评估联合治疗
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞代谢功能
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 代谢组学 | AbsoluteIDQ p180试剂盒 | BIOCRATES Life Sciences AG | -- |
| MS/MS Sciex三重四极杆6500质谱仪 | AbSciex | -- | |
| 1290 Infinity液相色谱 | Agilent Technologies | -- | |
| 代谢检测 | Seahorse XF96分析仪 | Seahorse Bioscience, Agilent | -- |
| 药物处理 | 2,2-二氯苯乙酮 | Sigma | -- |
| CB-839 | Selleckchemicals | s7655 | |
| UPGL00004 | Sigma-Aldrich | SML2472 | |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | D8375 | |
| 细胞培养 | 淋巴细胞分离液 | Alere technologies | -- |
| autoMACS造血祖细胞磁珠分选试剂盒 | Miltenyi Biotech | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Life Technologies | -- | |
| 流式分析 | 抗人FcR封闭剂 | Mylteni Biotech | -- |
| 抗CD34抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD38抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD45抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD25抗体 | Biolegend | 302606 | |
| Annexin V（FITC） | Mylteni Biotech | -- | |
| ROS检测 | 2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯 | Sigma Aldrich | -- |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma Aldrich | -- | |
| Western blot | 磷酸化PDH Ser293抗体 | Millipore, Calbiochem | AP1062 |
| 磷酸化PDH Ser232抗体 | Millipore | AP1063 | |
| 磷酸化PDH Ser300抗体 | Millipore, Calbiochem | AP1064 | |
| PDH E1α抗体 | Abcam | ab110330 | |
| Actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-47778 | |
| Actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| OXPHOS抗体混合物 | Thermo Fisher Scientific | 45-8199 | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 4–15% Mini Protean TGX预制胶 | Bio-rad | 4561085 | |
| Trans-blot Turbo RTA转印试剂盒 | Bio-rad | 1704274 | |
| Odyssey封闭液 | Li-Cor | 927-40000 | |
| qPCR | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | -- |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| SsoAdvanced SYBR Green预混液 | Bio-Rad | -- | |
| 慢病毒转导 | Fugene转染系统 | Promega | -- |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| 酶活性检测 | L-乳酸脱氢酶 | Sigma Aldrich | -- |
| 谷氨酰胺酶 | Sigma Aldrich | G8880 | |
| 谷氨酸脱氢酶 | Sigma Aldrich | -- | |
| Multiskan Sky酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 动物实验 | 白消安 | Sigma-Aldrich | -- |
| D-荧光素 | PerkinElmer | -- | |
| IVIS Lumina成像系统 | Caliper Life Sciences Inc | -- | |
| 液态细胞外基质 | Corning | 354230 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原发AML与健康CD34+样本来源与分选 | AML样本来源（单采产品、外周血或骨髓）、健康CB与PB来源、CD34+磁珠分选流程、样本量（AML n=42/27等） 阅读提示：Methods中AML and healthy primary cell isolations and in vitro cell culture conditions及Fig. 1图注 |
| 代谢组学检测 | 细胞数量5–10×10^6、AbsoluteIDQ p180试剂盒流程、LC-MS/MS与FIA-MS/MS检测条件、蛋白归一化方法 阅读提示：Methods中Mass spectrometry-based-targeted metabolomics assay |
| Seahorse代谢通量检测 | 细胞接种数（细胞系100,000、原发细胞200,000）、寡霉素A 2.5 μM、FCCP 2.5 μM、鱼霉素A 2 μM与鱼藤酮2 μM、2-DG 100 mM及加样顺序 阅读提示：Methods中Oxygen consumption and extracellular acidification rate measurements及Fig. 2e、Fig. 4图注 |
| shRNA敲低PDK1 | shPDK1#1与shPDK1#2序列、shLuc对照序列、慢病毒转导与GFP分选效率 阅读提示：Methods中ShRNA design and lenti-viral transduction |
| DAP及联合用药体外处理 | DAP浓度10、20 μM，CB-839 0.5 μM，UPGL00004 0.5 μM，处理24 h至3天，MS5基质共培养条件 阅读提示：Methods中Reagents、Viability assays及Fig. 5、Fig. 6图注 |
| 人源化支架异种移植体内实验 | NSG小鼠周龄与性别、支架植入细胞组成（80% wt MSC、10% IL-3、10% TPO）、移植细胞数（1.5×10^6原发AML、1×10^6 KBM7）、辐照200 rad、DAP 15 mg/kg给药频率 阅读提示：Methods中In vivo assays using humanized scaffold nice xenograft models及Fig. 5l、m图注 |
| HL60、MV4-11、MOLM13移植小鼠体内实验 | busulfan 20 mg/kg预处理、移植细胞数5×10^5、DAP 20 mg/kg与UPGL00004 3 mg/kg腹腔注射、分组样本量（n=4至5） 阅读提示：Methods中In vivo assays using MOLM13, MV411, and HL60 cells及Fig. 6图注 |