筛选与HBc相互作用的ISG
鉴定调控HBV产生的HBc结合ISG。
构建130个肝细胞ISG的cDNA文库，在HEK293细胞中共表达NanoLuc-HBc和HaloTag-ISG，进行NanoBRET筛选；在HepG2细胞中转染pHBV和候选ISG，qPCR检测上清病毒DNA。
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Galectin-9通过p62/SQSTM1介导的病毒核心蛋白选择性自噬限制乙型肝炎病毒复制
Galectin-9 restricts hepatitis B virus replication via p62/SQSTM1-mediated selective autophagy of viral core proteins.
实验完整度
高含BRET筛选、多种细胞系、原代人肝细胞、自噬/泛素化机制验证及体内样感染模型
主要模型
HEK293细胞 HepG2细胞 HepG2.2.15.7细胞 原代人肝细胞（PHHs）
重点核对
NanoBRET筛选130个ISG与HBc的相互作用，以NL-HBc与HT-HBc为阳性对照，n=3独立实验 HepG2细胞转染pHBV和ISG表达载体，转染后4小时洗细胞，3天后qPCR检测上清病毒DNA，n=3 HBc降解实验：转染HA-HBc和GFP-GAL9，BafA1（100 µM）或MG132（10 µM）处理16小时，n=3 PHHs感染HBV（500 GEq/cell），感染后11天检测上清HBcAg、病毒DNA和细胞内cccDNA，n=3 IFN-β处理PHHs（100 U/mL，感染前3小时加入），检测GAL9表达和病毒core释放，n=3
摘要
自噬已被认为具有广泛功能，包括防御宿主细胞抵抗病原体的降解过程。尽管自噬参与HBV感染已逐渐明确，但选择性自噬是否在限制HBV中发挥关键作用仍不清楚。在此，我们报道半乳糖凝集素家族成员GAL9引导HBV HBc的自噬性降解。BRET筛选揭示GAL9在活细胞中与HBc相互作用。GAL9的异位表达通过与另一抗病毒因子viperin相互作用诱导含HBc的胞质斑点形成，viperin与自噬体标记LC3共定位。机制上，GAL9通过viperin在胞质斑点处与HBc结合，并增强RNF13的自身泛素化，导致p62招募以形成LC3阳性自噬体。值得注意的是，GAL9和viperin均为I型IFN刺激基因，在HBV感染的肝细胞中协同作用于IFN依赖性的HBc蛋白水解。总之，这些结果揭示了感染细胞中一种此前未描述的针对HBV的抗病毒机制，以及病毒感染中先天免疫系统与选择性自噬之间的一种串扰形式。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 宿主先天免疫系统是否可通过选择性自噬触发HBV核心蛋白的降解，以及哪些ISG分子介导该过程。
- 核心机制
- GAL9通过viperin与HBc结合，增强RNF13自身泛素化，招募p62形成LC3阳性自噬体，从而选择性自噬降解HBc；GAL9和viperin均为I型IFN刺激基因，协同促进IFN依赖的HBc蛋白水解。
- 主要证据
- NanoBRET筛选鉴定GAL9与HBc相互作用；GAL9过表达降低HBc蛋白但不影响mRNA，该降解被BafA1而非MG132挽救，且依赖ATG5；viperin、RNF13、p62缺失分别减弱GAL9-HBc结合、HBc泛素化和降解；PHHs中GAL9过表达减少感染性病毒颗粒释放和cccDNA，GAL9敲低减弱IFN-β抗病毒效应。
- 研究意义
- 揭示了一种此前未描述的针对HBV的先天抗病毒机制，以及先天免疫系统与选择性自噬在病毒感染中的串扰形式，为减少HBV感染细胞产生子代病毒颗粒的治疗策略提供了线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证GAL9对HBc的降解及自噬依赖性
确定GAL9是否通过自噬途径降解HBc。
在HepG2细胞中共转染HA-HBc和GFP-GAL9，检测HBc蛋白和mRNA；使用BafA1或MG132处理；ATG5敲低后检测HBc降解。
解析GAL9-HBc-viperin复合物及HBc斑点形成
探究viperin在GAL9与HBc相互作用及HBc胞质斑点形成中的作用。
免疫共沉淀检测GAL9与不同基因型HBc的结合；NanoBRET和体外pull-down检测viperin与HBc/GAL9的相互作用；免疫荧光观察GAL9、HBc、viperin和LC3共定位；viperin敲低后检测HBc斑点和降解。
验证p62介导的选择性自噬机制
确定p62在GAL9介导的HBc降解中的作用及其功能域需求。
免疫共沉淀检测GAL9与p62、NDP52、OPTN的相互作用；p62敲低及回补野生型或ΔUBA/ΔLIR突变体；免疫荧光观察p62与HBc共定位。
验证RNF13在HBc复合物泛素化中的作用
鉴定负责HBc复合物泛素化的E3连接酶及其与GAL9的调控关系。
免疫共沉淀检测GAL9与RNF13相互作用及GAL9诱导的HBc复合物泛素化；去糖基化处理检测GAL9与RNF13结合；体外泛素化实验检测RNF13自身泛素化；RNF13敲低及回补实验。
评估GAL9对HBV复制的影响及IFN依赖性
验证GAL9在HBV感染模型中的抗病毒功能及其与IFN的关系。
构建HepG2-tet-GAL9细胞，转染pHBV后多西环素诱导GAL9，检测HBc、HBs、HBcAg和病毒DNA；PHHs转导GAL9后感染HBV，检测感染性病毒释放和cccDNA；PHHs敲低GAL9后IFN-β处理，检测病毒core释放。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白质相互作用
验证亚细胞定位与共定位
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| NanoBRET分析 | NanoBRET Nano-Glo检测系统 | Promega | N1661 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Wako | 043-30085 |
| DMEM/F-12 GlutaMAX培养基 | Thermo | 10565018 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| HEPES | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo | 13778030 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo | L3000001 | |
| 胶原包被培养皿 | -- | -- | |
| HepG2-Tet-On Advanced细胞 | Takara Bio | 630932 | |
| 编码GAL9的逆转录病毒载体 | -- | -- | |
| 基因敲低 | GAL9 siRNA | Qiagen | SI03188409, SI04259066 |
| p62 siRNA | Qiagen | SI00057596, SI03089023 | |
| RNF13 siRNA | Qiagen | SI00096229, SI00096236 | |
| ATG5 siRNA | Qiagen | SI00069265, SI02633946 | |
| viperin siRNA | Qiagen | SI00708484, SI04354700 | |
| 对照siRNA | Qiagen | 1027281 | |
| GAL9 shRNA慢病毒颗粒 | Santa Cruz | sc-35444-V | |
| RNF13 shRNA慢病毒颗粒 | Santa Cruz | sc-78079-V | |
| p62 shRNA慢病毒颗粒 | Santa Cruz | sc-29679-V | |
| ATG5 shRNA慢病毒颗粒 | Santa Cruz | sc-41445-V | |
| 病毒DNA提取 | QIAamp DNA血液迷你试剂盒 | Qiagen | 51104 |
| 实时PCR | TB Green Premix Ex Taq II | Takara Bio | RR820S |
| CFX-96系统仪器 | Bio-Rad | -- | |
| HBcAg检测 | QuickTiter HBcAg ELISA试剂盒 | Cell Biolabs | VPK-150 |
| HBV感染 | PEG病毒沉淀试剂盒 | BioVision | K904-50 |
| 0.45 µm滤器 | Merck | SLHV033RB | |
| IFN处理 | IFN-β | Wako | 092-06061 |
| RNA提取 | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| HBc降解分析 | 巴弗洛霉素A1 | Merck | 196000 |
| MG132 | Merck | 474790 | |
| Western blot | 10–20%梯度胶 | Wako | 198-15041 |
| PVDF膜 | Merck | IPVH00010 | |
| FluorChem数字成像系统 | Alpha Innotech | -- | |
| LuminoGraph成像系统 | ATTO | -- | |
| 逆转录 | ReverTra Ace逆转录酶 | Toyobo | TRT-101 |
| 免疫共沉淀 | 蛋白G Sepharose | Cytiva | 17061801 |
| EZview Red亲和胶 | Merck | E6779, F2426, E6654 | |
| GFP-Trap琼脂糖 | Chromotek | gta-10 | |
| Halo-Trap | Chromotek | ota-10 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Merck | 4693124001 | |
| 体外泛素化 | UBE1 | Merck | SRP6147 |
| UBcH5c | Merck | 662098 | |
| 泛素 | Merck | U5507 | |
| GAL9重组蛋白 | Wako | 074-06421 | |
| E3连接酶缓冲液 | R&D Systems | B-71 | |
| 抗UBE1抗体 | Santa Cruz | sc-53555 | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz | sc-8017 | |
| 免疫荧光 | 10%正常山羊血清 | Thermo | 50062Z |
| CellMask试剂 | Thermo | C37608 | |
| FV1000-D共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | -- | |
| 活细胞成像 | 胶原包被玻璃底培养皿 | Matsunami | D11134H |
| Biostation IM-Q | Nikon | -- | |
| 质粒构建 | pNLF1-C载体 | Promega | -- |
| pEGFP载体 | Takara Bio | -- | |
| pmCherry载体 | Takara Bio | -- | |
| GFP-LC3表达质粒 | Addgene | 11546 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NanoBRET筛选 | ISG文库规模（130个）、NL-HBc与HT-ISG转染量（100 ng HT融合蛋白、1 ng NanoLuc融合蛋白）、阳性对照（NL-HBc与HT-HBc）、配体/底物添加时间（36 h/48 h）、检测仪器 阅读提示：Methods 'NanoBRET-based protein–protein interaction assay'及Fig. 1a图注 |
| HBV产生实验 | HepG2细胞转染pHBV（1 μg）和ISG表达载体（1.5 μg）、转染后4小时洗细胞、3天后检测上清病毒DNA、qPCR方法 阅读提示：Methods 'Transfection-based HBV production assay'及Fig. 1b图注 |
| HBc降解实验 | HA-HBc（200 ng）与GFP-GAL9（400–800 ng）共转染、BafA1（100 µM）或MG132（10 µM）处理16小时、siRNA预处理时间（前一天，20 pmol） 阅读提示：Methods 'HBc degradation analysis'及Fig. 2b、c图注 |
| HBV感染PHHs实验 | PHHs来源（PhoenixBio #PPC-P12）、HBV感染量（500 GEq/cell）、感染后11天检测、IFN-β处理浓度（100 U/mL）和时间（感染前3小时） 阅读提示：Methods 'HBV infection assay'及Fig. 6c–i图注 |
| 体外泛素化实验 | E1（100 nM）、E2（1 µM）、ubiquitin（5 µM）、GAL9（1 µM）、MgATP（10 mM）、反应温度和时间（30°C，1小时） 阅读提示：Methods 'In vitro ubiquitination assay'及Fig. 5g图注 |
| 统计学分析 | 双尾非配对t检验、P<0.05为显著性、重复数（n=3或n≥2） 阅读提示：Methods 'Statistical analysis'及各图注 |