母体丁酸盐喂养与RRV诱导新生小鼠胆道闭锁模型建立
验证母体摄入丁酸盐是否影响新生小鼠对实验性胆道闭锁的易感性。
孕鼠饮水给予200 mmol/L丁酸钠或对照水，新生小鼠出生24 h内腹腔注射RRV，观察黄疸、存活、血清ALT和总胆红素、EHBD和肝脏组织学及病毒滴度。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
母体通过肠道微生物代谢物调控新生儿胆道疾病
Maternal regulation of biliary disease in neonates via gut microbial metabolites.
实验完整度
高含体外细胞实验、新生小鼠RRV模型、16s rRNA测序、NMR代谢组及102例BA婴儿粪便宏基因组
主要模型
新生BALB/c小鼠RRV诱导胆道闭锁模型 RRV感染小鼠肝脏单个核细胞 小鼠胆管细胞系mCL 胆道闭锁婴儿粪便样本队列
重点核对
母鼠饮水添加200 mmol/L丁酸钠（pH 7.5），孕期及产后4周持续给药 新生小鼠出生24 h内腹腔注射1.5×10^6 ffu RRV，对照注射PBS或生理盐水 新生小鼠口服丁酸盐0.3 mg/g体重或腹腔注射谷氨酰胺0.25 mg/g、肌苷0.2 mg/g体重，隔日给药 谷氨酰胺8–16 mM处理及NAC 5 mM预处理用于NK细胞-胆管细胞共培养杀伤实验 人粪便样本：102例BA与28例年龄匹配对照，采集诊断时术前粪便
摘要
新生儿期母体微生物组的定植会留下持久的生物学印记，但其如何影响生命早期的疾病易感性仍不清楚。我们假设给孕鼠喂食丁酸盐会影响新生小鼠对胆道闭锁（一种新生儿严重胆管病）的易感性。在此，我们发现给母鼠施用丁酸盐可使新生小鼠对胆管炎症和损伤产生抵抗并提高存活率。肝脏免疫细胞激活的预防和存活特征与拟杆菌门和梭菌纲的粪便特征相关，并伴有新生小鼠粪便代谢物中谷氨酸/谷氨酰胺和次黄嘌呤的增加。在患胆道闭锁的人类新生儿中，这些细菌的粪便微生物组特征呈现不足，同时谷氨酸/谷氨酰胺通路受到抑制而次黄嘌呤通路增加。直接给新生小鼠施用丁酸盐或谷氨酰胺可减轻疾病表型，但只有谷氨酰胺能使胆管上皮细胞抵抗自然杀伤细胞的细胞毒性。因此，母体摄入丁酸盐会影响新生小鼠的粪便微生物种群和代谢物以及实验性胆道闭锁的表型表达，其中谷氨酰胺促进胆管上皮细胞的存活。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 母体摄入丁酸盐是否通过影响新生儿肠道微生物组组成与功能，调节新生小鼠对实验性胆道闭锁的易感性。
- 核心机制
- 母体丁酸盐富集新生儿肠道拟杆菌门和梭菌纲并增加谷氨酸/谷氨酰胺，谷氨酰胺通过提高胆管上皮细胞内GSH使胆管细胞抵抗NK细胞介导的细胞毒性，从而保护胆管。
- 主要证据
- 丁酸盐喂养母鼠的RRV感染新生小鼠胆管通畅、黄疸和死亡率降低；粪便16s rRNA测序和1H-NMR代谢组显示微生物与代谢物特征改变；谷氨酰胺处理提高存活率并减少NK细胞对胆管细胞的裂解，且伴随GSH升高；BA婴儿粪便中相应菌群和代谢通路呈现不足。
- 研究意义
- 提示新生儿发育中的微生物组是受母体影响、可调节生命早期疾病易感性的因素，并提出丁酸盐和/或谷氨酰胺可能用于调节BA或其他儿童肝胆疾病的免疫反应并辅助组织修复。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
丁酸盐直接给药与免疫细胞表型分析
确定丁酸盐是否直接保护新生小鼠并影响肝脏免疫细胞活化。
RRV感染新生小鼠口服丁酸钠，检测黄疸、存活、病毒滴度和组织学；流式细胞术分析肝脏单个核细胞亚群；体外培养肝脏MNC并加入丁酸盐检测Il10和Foxp3 mRNA。
粪便微生物组与代谢物分析
寻找与疾病抵抗相关的微生物和代谢物特征。
采集母鼠分娩前及新生小鼠感染后12–14天粪便，进行16s rRNA测序OTU分析和1H-NMR代谢组学；用粪便上清刺激肝脏MNC检测Il10、Foxp3、Tnfa表达。
人婴儿粪便宏基因组分析
评估小鼠微生物和代谢特征与人类胆道闭锁的相关性。
对102例BA婴儿和28例正常对照粪便进行鸟枪法宏基因组测序，分析菌群组成及MetaCyc功能通路。
谷氨酰胺/肌苷体内干预与体外细胞毒性机制验证
验证谷氨酰胺或肌苷对胆道闭锁表型的直接作用及谷氨酰胺保护胆管细胞的机制。
RRV感染新生小鼠腹腔注射谷氨酰胺、肌苷或联合处理，检测黄疸、存活、ALT、胆红素和组织学；体外NK细胞-胆管细胞共培养检测裂解率，并检测GSH水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
验证分子表达变化
分析微生物组与代谢物
评估氧化还原状态
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 母体给药 | 丁酸钠 | Sigma-Aldrich | 303410 |
| 新生小鼠腹腔注射 | 肌苷 | Sigma-Aldrich | I4125 |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G5792 | |
| 口服灌胃 | Hamilton注射器Model 1702 | Hamilton | 80201 |
| 柔性口服灌胃导管 | PetSurgical | MDAFN2425S | |
| 血浆生化检测 | 总胆红素试剂盒 | Pointe Scientific Inc. | B7538-120 |
| DiscretPak ALT试剂盒 | Catachem | V164-0A | |
| Synergy H1混合读板器 | BioTek | -- | |
| 肝脏单个核细胞分离 | gentleMACS组织解离器 | Miltenyi Biotec | 130-093-235 |
| 流式细胞术 | FITC抗小鼠CD3抗体 | eBioscience | 11-0032-82 |
| Pacific Blue抗小鼠CD4抗体 | BioLegend | 100531 | |
| APC抗小鼠CD8a抗体 | eBioscience | 17-0081-81 | |
| PE/Cy7抗小鼠CD25抗体 | SouthernBiotech | 1595-17 | |
| PerCP/Cy5.5抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 100218 | |
| FITC抗小鼠/大鼠Foxp3抗体 | eBioscience | 11-5773-80 | |
| PE抗小鼠IL-10抗体 | eBioscience | 12-7101-41 | |
| APC抗小鼠CD49b抗体 | BioLegend | 108910 | |
| PerCP/Cy5.5抗小鼠CD11b抗体 | eBioscience | 101228 | |
| APC/Cy7抗小鼠Gr-1抗体 | BioLegend | 108424 | |
| Pacific Blue抗小鼠F4/80抗体 | BioLegend | 123124 | |
| FITC抗小鼠CD11c抗体 | BioLegend | 117306 | |
| APC-eFluor 780抗人/小鼠B220抗体 | eBioscience | 47-0452-82 | |
| APC抗小鼠PDCA-1抗体 | Miltenyi Biotec | 130-102-260 | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | Life Technologies Corporation | 00-5523-00 | |
| 流式分析 | FACSCantoII双激光流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 细胞培养 | Percoll密度梯度分离液 | Sigma-Aldrich | P4937 |
| RNA提取 | miRNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | 217004 |
| RT-qPCR | AriaMx实时PCR系统 | Agilent Technologies | -- |
| NK细胞分离 | 小鼠NK细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-115-818 |
| 细胞因子处理 | 重组小鼠IL-10 | BioLegend | 575804 |
| 细胞毒性检测 | CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒 | Promega | G1780 |
| GSH测定 | 谷胱甘肽检测试剂盒 | BioVision | K261 |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | -- |
| NMR代谢组学 | NANOSEP 3K离心过滤器 | Pall Life Sciences | OD003C34 |
| 核磁管 | Bruker | Z112272 | |
| Bruker Avance II 600 MHz核磁共振波谱仪 | Bruker | -- | |
| DNA提取 | QIAamp粪便DNA迷你试剂盒 | Qiagen | 51504 |
| DNA定量 | Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific Inc. | Q32854 |
| 测序文库 | MiSeq试剂盒v2 | Illumina | MS-102-2003 |
| 测序 | Illumina MiSeq测序平台 | Illumina | -- |
| 人粪便DNA提取 | MagPure粪便DNA KF试剂盒 | Angen Biotech | MD5115 |
| 人粪便DNA定量 | Qubit双链DNA BR检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | Q32850 |
| 文库纯化 | AxyPrep磁珠PCR纯化试剂盒 | Axygen | MAG-PCR-CL-250 |
| Agencourt AMPure XP PCR纯化试剂盒 | Beckman Coulter | A63881 | |
| 人粪便宏基因组测序 | Illumina Novaseq 6000测序平台 | BGI-Shenzhen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 母体丁酸盐喂养 | 丁酸钠浓度200 mmol/L、pH 7.5、孕期至产后4周持续给药 阅读提示：Methods 'Mice, experimental model of BA, and experimental procedures' 及 Fig. 1A |
| RRV诱导胆道闭锁 | 新生BALB/c小鼠出生24 h内腹腔注射1.5×10^6 ffu RRV（20 µl） 阅读提示：Methods 'Mice, experimental model of BA, and experimental procedures' |
| 新生小鼠药物处理 | 口服丁酸盐0.3 mg/g体重每日；腹腔注射谷氨酰胺0.25 mg/g、肌苷0.2 mg/g体重隔日，均自感染后1天开始 阅读提示：Methods 'Mice, experimental model of BA, and experimental procedures' 及 Fig. 6A |
| 体外NK细胞杀伤实验 | 效靶比1:16、谷氨酰胺8–16 mM、NAC 5 mM预处理2 h、共培养时间3–5 h 阅读提示：Methods 'In vitro cytotoxicity assay' 及 Fig. 7 |
| 人粪便宏基因组队列 | BA 102例、对照28例，诊断时术前采集，年龄匹配范围2周至6个月 阅读提示：Methods 'Human study and stool sample collection' 及 Fig. 5A |