体外RNA捕获筛选移码元件互作蛋白
鉴定与SARS-CoV-2 –1PRF RNA元件直接结合的宿主蛋白。
将SARS-CoV-2基因组13456-13570位RNA与感染及未感染Calu-3细胞和HEK293细胞裂解液孵育，通过生物素化反义DNA寡核苷酸捕获，LC-MS/MS鉴定互作蛋白。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
宿主抗病毒蛋白ZAP短亚型作为SARS-CoV-2程序性核糖体移码的抑制剂
The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting.
实验完整度
高包含体外RNA捕获、细胞荧光报告、感染模型、体外翻译、单分子光学镊子等多层级功能与机制验证。
主要模型
SARS-CoV-2感染Calu-3细胞 HEK293细胞双荧光移码报告系统 ZAP-S过表达Huh7细胞感染模型 兔网状红细胞裂解物体外翻译系统
重点核对
双荧光报告系统中ZAP-S过表达使移码效率降低最多50% ZAP-S过表达使Huh7细胞中SARS-CoV-2病毒滴度降低约20倍 体外翻译中3 µM ZAP-S使移码效率从46%降至约26% MST显示ZAP-S与野生型移码RNA结合KD=110±9 nM 光学镊子显示ZAP-S存在时野生型PK RNA再折叠工作显著减少
摘要
程序性核糖体移码（PRF）是包括SARS-CoV-2在内的许多病毒中的基本基因表达事件。它允许产生以替代阅读框编码的必需病毒结构酶和复制酶。尽管PRF对病毒生命周期很重要，但细胞因子如何以及在多大程度上改变移码元件的机械特性并由此影响毒力仍很大程度上未知。这促使我们全面剖析SARS-CoV-2移码元件与宿主蛋白质组之间的相互作用。我们揭示锌指抗病毒蛋白短亚型（ZAP-S）是SARS-CoV-2感染细胞中PRF的直接调节因子。ZAP-S过表达强烈损害移码并抑制病毒复制。利用体外整体和单分子技术，我们进一步证明ZAP-S直接与SARS-CoV-2 RNA相互作用并干扰移码RNA元件的折叠。总之，这些数据确定ZAP-S是SARS-CoV-2移码的宿主编码抑制剂，并扩展了我们对基于RNA的基因调控的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞因子如何改变SARS-CoV-2移码元件的机械特性并影响移码效率？
- 核心机制
- ZAP-S直接结合SARS-CoV-2移码RNA的SL2和SL3区域，干扰移码RNA元件的折叠与再折叠，从而降低移码效率。
- 主要证据
- 体外RNA捕获鉴定ZAP-S为移码RNA互作因子；双荧光报告和体外翻译显示ZAP-S抑制移码；MST和EMSA证实直接结合；光学镊子显示ZAP-S损害PK再折叠。
- 研究意义
- 确定ZAP-S为SARS-CoV-2移码的宿主编码抑制剂，扩展了对RNA基因调控及病毒复制与宿主防御相互作用的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞双荧光报告系统筛选移码调节因子
评估候选RNA结合蛋白对SARS-CoV-2移码效率的影响。
将候选蛋白与ECFP融合表达，与EGFP-mCherry双荧光移码报告质粒共转染HEK293细胞，流式细胞术检测mCherry/EGFP比值计算移码效率。
ZAP-S过表达对SARS-CoV-2复制的影响
验证ZAP-S在感染细胞中对病毒复制的作用。
用稳定过表达ALFA标签ZAP-S的Huh7细胞感染SARS-CoV-2，感染前1小时用干扰素处理或未处理，24小时后收集上清进行噬斑滴定。
体外翻译验证ZAP-S对移码的直接作用
确定ZAP-S是否直接作用于天然SARS-CoV-2 mRNA移码，无需辅因子。
在兔网状红细胞裂解物中翻译含SARS-CoV-2基因组12686-14190位和N端FLAG标签的报告mRNA，滴定ZAP-S浓度，Western blot检测0帧和–1帧产物。
ZAP-S与移码RNA直接结合及结构变化分析
验证ZAP-S与SARS-CoV-2移码RNA的直接结合及对RNA结构的影响。
用微量热泳动（MST）测定ZAP-S与野生型及突变移码RNA的结合亲和力；EMSA分析结合化学计量；DMS-MaPseq分析RNA结构变化。
单分子光学镊子分析ZAP-S对移码RNA机械性质的影响
研究ZAP-S是否改变移码RNA的折叠与再折叠机械特性。
将SARS-CoV-2 PK RNA（13475-13542位）与DNA手柄杂交并固定于聚苯乙烯珠，用光学镊子进行力-距离曲线测量，分析ZAP-S存在下的展开和再折叠。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞双荧光移码报告检测 | 转染后检测时间24小时；质粒共转染摩尔比1:1；以ECFP空载体为对照；每组3次独立实验 阅读提示：Methods流式细胞术部分及Fig. 2C图注 |
| ZAP-S过表达抑制病毒复制 | 感染剂量20,000 PFU/ml（MOI 0.03）；感染后24小时收样；干扰素处理浓度IFN-β 500 U/ml、IFN-γ 500 U/ml、IFN-λ1 5 ng/ml；每组4次独立实验 阅读提示：Methods SARS-CoV-2感染部分及Fig. 2D图注 |
| 体外翻译滴定ZAP-S | RRL浓度75% v/v；模板mRNA约50 µg/ml；ZAP-S浓度0–3 µM；30°C孵育1小时；每个条件至少3次独立实验 阅读提示：Methods体外翻译检测部分及Fig. 3B、3C图注 |
| MST结合亲和力测定 | RNA浓度5 nM；ZAP-S浓度40 pM–2 µM；25°C；5% LED强度；中等MST功率；MST on-time 2.5 s；3次测量 阅读提示：Methods微量热泳动部分及Fig. 4C–H图注 |
| 光学镊子单分子分析 | ZAP-S浓度400 nM；拉伸速度0.05 µm/s；阱刚度0.31和0.24 pN/nm；数据采集频率78125 Hz；每条曲线来自指定分子数 阅读提示：Methods光学镊子数据收集与分析部分及Fig. 5D–K图注 |