构建氧化葡萄糖酸杆菌基因敲除文库以提高稀土元素提取效率

Generation of a Gluconobacter oxydans knockout collection for improved extraction of rare earth elements.

作者信息Alexa M Schmitz, Brooke Pian, Sean Medin, Matthew C Reid, Mingming Wu, Esteban Gazel, Buz Barstow
PMID34795278
发布时间2021-11-18
DOI10.1038/s41467-021-27047-4

实验完整度

高

构建全基因组敲除文库,结合高通量筛选、直接pH验证和RPP生物浸出功能验证。

主要模型

氧化葡萄糖酸杆菌B58 转座子插入突变体文库 RPP生物浸出体系

重点核对

突变体文库覆盖2733个基因, condensed collection含17706个突变体 TB法测定终点pH,BPB法测定酸化速率 直接pH测量验证22株突变体 RPP生物浸出实验使用10株低pH和4株高pH突变体 ICP-MS测定浸出液中稀土元素浓度

摘要

利用微生物进行稀土元素生物浸出,为热化学提取提供了一种环境友好的替代方法。在此,Schmitz等人针对一种此类微生物——氧化葡萄糖酸杆菌,构建了全基因组突变体敲除文库,并鉴定了影响酸性生物浸出液产生及生物浸出效率的基因。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
能否通过全基因组敲除文库鉴定影响氧化葡萄糖酸杆菌生物浸出效率的基因?
核心机制
磷酸转运系统基因破坏解除对产酸的抑制,PQQ合成和mGDH基因破坏减少葡萄糖酸产生从而降低生物浸出。
主要证据
筛选304个基因影响产酸,δpstC提高稀土提取18%,δmgdh和δpqqC分别降低97%和94%。
研究意义
为基因工程改造氧化葡萄糖酸杆菌提高生物浸出效率提供路线图,并拓展其在其他工业产品中的应用。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

构建全基因组敲除文库

获得覆盖氧化葡萄糖酸杆菌B58全基因组的单基因破坏突变体文库

使用Knockout Sudoku方法构建转座子插入突变体文库,并浓缩为 condensed collection

2

高通量筛选产酸突变体

鉴定影响生物浸出液酸性的基因

使用百里酚蓝和溴酚蓝两种指示剂分别筛选终点pH和酸化速率

3

直接pH验证候选突变体

验证高通量筛选结果并确认产酸变化

选取22株突变体进行直接pH测量

4

RPP生物浸出验证

验证产酸变化是否影响稀土元素提取效率

选取10株低pH和4株高pH突变体进行RPP生物浸出实验

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
酵母提取物Hardy DiagnosticsC7341
蛋白胨BD211677
甘露醇VWR ChemicalsBDH9248
Quick-DNA Miniprep试剂盒Zymo ResearchD3024
TruSeq DNA PCR-Free文库制备试剂盒Illumina--
卡那霉素----
二氨基庚二酸Sigma-AldrichD1377
百里酚蓝Sigma-AldrichSKU114545
溴酚蓝Bio-Rad161-0404
焙烧磷粉----
稀土元素混合标准品Sigma-Aldrich67349
铑内标Sigma-AldrichSKU04736
AcroPrep Advance 96孔过滤板Pall Corporation8029
硝酸J.T. BakerJT9368

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
高通量产酸筛选
培养基成分(YPM)、葡萄糖终浓度(20% w/v)、染料浓度、培养时间和温度
阅读提示:Methods中“Thymol blue endpoint acidity assay”和“Bromophenol blue acidification rate screen”小节
直接pH测量
培养体积、葡萄糖终浓度、重复数、pH校准标准
阅读提示:Methods中“Direct measurement of biolixiviant pH”小节
RPP生物浸出
RPP用量(20 mg, 4% w/v)、浸出时间(36 h)、温度、稀释倍数、ICP-MS参数
阅读提示:Methods中“Direct measurement of REE bioleaching”小节
突变体文库构建
转座子质粒、接合比例、筛选抗生素浓度、 colony picking 参数
阅读提示:Methods中“Mating for transposon insertional mutagenesis”和“Curation of a whole-genome knockout collection”小节