建立成熟CD8+ T细胞特异性Tcf1/Lef1双敲除模型
在成熟外周CD8+ T细胞中特异性敲除Tcf1和Lef1，避免胸腺发育阶段的影响。
将hCD2-Cre与Tcf7fl/fl和Lef1fl/fl杂交，利用Rosa26GFP标记敲除细胞，分选GFP+TCRβ+CD8+CD62L+CD44lo-med naïve CD8+ T细胞。
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Tcf1和Lef1通过组织基因组架构对成熟CD8+ T细胞身份和功能提供持续监督
Tcf1 and Lef1 provide constant supervision to mature CD8+ T cell identity and function by organizing genomic architecture.
实验完整度
高包含体外细胞模型、Hi-C、ChIP-seq、DNase-seq、RNA-seq多组学及体内 adoptive transfer 和病毒感染功能验证
主要模型
hCD2-Cre介导的Tcf7/Lef1条件性敲除小鼠成熟CD8+ T细胞 P14 TCR转基因CD8+ T细胞过继转移及LCMV-Armstrong感染模型
重点核对
hCD2-Cre+Rosa26GFP Tcf7fl/fl Lef1fl/fl（dKO）与WT小鼠，分析GFP+TCRβ+CD8+CD62L+CD44lo-med naïve CD8+ T细胞 Hi-C使用3e Hi-C方法，4×10^6细胞/重复，WT和dKO各两个生物学重复 Tcf1 ChIP-seq使用重组全长Tcf1蛋白免疫制备的抗血清，以Tcf7−/− CD8+ T细胞为阴性对照 DNase-seq WT 3个重复、dKO 2个重复，每重复3×10^5细胞 Adoptive transfer：1×10^6 CTV标记P14细胞经尾静脉转移至CD45.1+受体，LCMV-Armstrong 1×10^6 PFU感染
摘要
T细胞身份在胸腺发育过程中建立，但其在外周如何维持尚不清楚。我们在此证明，在成熟CD8+ T细胞中敲除Tcf1和Lef1转录因子会异常诱导非T细胞谱系的基因。利用高通量染色体构象捕获测序，我们证明Tcf1/Lef1对于维持CD8+ T细胞中多个尺度的三维基因组组织具有重要作用。综合网络分析结合染色质可及性和Tcf1结合的全基因组分析表明，Tcf1/Lef1对T细胞基因组的直接影响是通过强制染色质相互作用和可及性来促进广泛互联的枢纽形成。Tcf1/Lef1利用的整合机制支持T细胞身份基因的激活和非T谱系基因的抑制，从而精细控制多种T细胞功能。这些发现提示Tcf1/Lef1控制整体基因组组织并帮助形成复杂的染色质相互作用枢纽以促进启动子-增强子/沉默子接触，从而对CD8+ T细胞身份和功能提供持续监督。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 成熟CD8+ T细胞在外周如何维持其细胞身份和功能，Tcf1/Lef1转录因子是否通过组织三维基因组架构发挥持续监督作用。
- 核心机制
- Tcf1/Lef1通过直接结合位点维持染色质开放状态、促进染色质环和染色质相互作用枢纽形成，并调控超级增强子活性，从而激活T细胞身份基因并抑制非T谱系基因；部分抑制功能可能通过间接机制实现。
- 主要证据
- Hi-C显示dKO CD8+ T细胞中A/B区室、TAD、染色质环和相互作用枢纽强度减弱；DNase-seq和H3K27ac ChIP-seq显示染色质可及性和超级增强子活性变化与染色质环强度一致；RNA-seq和GSEA显示非T谱系基因及效应/调节性T细胞基因在dKO中富集；体内过继转移和LCMV感染显示dKO P14细胞扩增和记忆表型受损。
- 研究意义
- 表明Tcf1/Lef1对成熟CD8+ T细胞身份和功能提供持续监督，防止谱系混淆，并揭示转录因子与三维基因组架构在转录调控中的整合作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Hi-C分析三维基因组组织
检测Tcf1/Lef1缺失对CD8+ T细胞基因组组织多个尺度的影响。
对WT和dKO naïve CD8+ T细胞进行3e Hi-C，分析A/B区室、TAD、染色质环和相互作用枢纽。
Tcf1 ChIP-seq鉴定直接和间接结合位点
全基因组定位Tcf1结合位点并区分直接与间接结合。
使用重组全长Tcf1蛋白免疫制备的抗血清进行ChIP-seq，以Tcf7−/− CD8+ T细胞为阴性对照，MACS2鉴定峰，HOMER进行motif分析。
DNase-seq和H3K27ac ChIP-seq分析染色质可及性和超级增强子
检测Tcf1/Lef1缺失对染色质开放状态和超级增强子活性的影响。
对WT和dKO naïve CD8+ T细胞进行DNase-seq和H3K27ac ChIP-seq，鉴定差异染色质可及性位点和超级增强子。
RNA-seq和GSEA分析转录输出
确定Tcf1/Lef1缺失对基因表达和免疫细胞谱系富集基因的影响。
对WT和dKO naïve CD8+ T细胞进行RNA-seq，鉴定差异表达基因，并使用免疫细胞谱系富集基因集进行GSEA。
整合多组学数据连接染色质架构与基因表达
将染色质可及性、超级增强子、染色质环和相互作用枢纽的变化与靶基因表达联系起来。
采用基因中心方法，将差异表达基因和差异谱系富集基因与差异染色质可及性位点、超级增强子和染色质相互作用枢纽关联。
体内过继转移和LCMV感染验证CD8+ T细胞功能
评估Tcf1/Lef1缺失对CD8+ T细胞归巢、记忆表型、增殖和效应分化的影响。
将WT和dKO P14 CD8+ T细胞过继转移至CD45.1+受体，LCMV-Armstrong感染，检测CTV稀释、CD25诱导、效应细胞扩增和细胞因子产生。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与刺激 | 佛波酯 | -- | -- |
| 离子霉素 | -- | -- | |
| 流式分析 | Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBiosciences, Thermo Fisher Scientific | -- |
| PE Annexin V凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | 559763 | |
| Hi-C | 蛋白酶抑制剂混合物 | MilliporeSigma | -- |
| CutSmart缓冲液 | NEB | -- | |
| CviQ I限制性内切酶 | NEB | -- | |
| CviA II限制性内切酶 | NEB | -- | |
| Bfa I限制性内切酶 | NEB | -- | |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Covaris S2超声破碎仪 | Covaris | -- | |
| ChIP-seq | Q125超声破碎仪 | QSonica | -- |
| 抗H3K27ac抗体 | Abcam | ab4729 | |
| DNase-seq | End-It DNA修复试剂盒 | Lucigen | ER81050 |
| Klenow片段（3'->5'外切酶-） | NEB | -- | |
| RNA-seq | SMARTer超低输入RNA试剂盒 | Takara Bio | 634848 |
| 免疫沉淀与免疫印迹 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | -- |
| Dynabeads Protein G磁珠 | Life Technologies | -- | |
| 抗FLAG抗体（克隆M2） | Millipore/Sigma-Aldrich | F3165 | |
| 抗Tcf1抗体（C46C7） | Cell Signaling Technology | 2206 S | |
| 抗c-MYB多克隆抗体 | Proteintech | 17800-1-AP | |
| 抗CLL5抗体（R6G9） | ThermoFisher Scientific | 14-7085-82 | |
| 抗β-actin抗体（I-19） | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 过继转移 | 细胞追踪染料Violet | ThermoFisher Scientific | C34557 |
| 组织消化 | II型胶原酶 | Life Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 成熟CD8+ T细胞特异性Tcf1/Lef1敲除 | hCD2-Cre+Rosa26GFP Tcf7fl/fl Lef1fl/fl与WT小鼠品系、6–12周龄、GFP+TCRβ+CD8+CD62L+CD44lo-med naïve细胞分选门 阅读提示：Methods的Mice和Cell isolation and flow cytometry小节 |
| Hi-C | 3e Hi-C酶切组合（CviQ I、CviA II、Bfa I各20单位）、4×10^6细胞/重复、WT和dKO各两个生物学重复、10 kb分辨率分析 阅读提示：Methods的High-resolution chromosome-conformation-capture (Hi-C)小节 |
| Tcf1 ChIP-seq | 抗Tcf1抗血清、Tcf7−/− CD8+ T细胞阴性对照、MACS2标准（fold enrichment ≥4，p < 10−5，FDR < 0.05）、Motif+阈值log odds ratio >7 阅读提示：Methods的Tcf1 ChIP-seq和Tcf1 ChIP-seq data processing小节 |
| DNase-seq和H3K27ac ChIP-seq | DNase-seq WT 3重复/dKO 2重复、3×10^5细胞/重复；H3K27ac ChIP-seq WT 4重复/dKO 3重复；edgeR FDR < 0.05 阅读提示：Methods的DNase-seq和H3K27ac ChIP-seq小节 |
| 过继转移和LCMV感染 | P14细胞数量（1×10^6或2×10^4）、CTV浓度10 μM、LCMV-Armstrong剂量（1×10^6 PFU静脉或2×10^5 PFU腹腔）、检测时间点（48-60小时或第8天） 阅读提示：Methods的Adoptive transfer and viral infection小节 |