乳腺特异性表达Trim24建立人化生性乳腺癌小鼠模型

Mammary-specific expression of Trim24 establishes a mouse model of human metaplastic breast cancer.

作者信息Vrutant V Shah, Aundrietta D Duncan, Shiming Jiang, Sabrina A Stratton, Kendra L Allton, Clinton Yam, Abhinav Jain, Patrick M Krause, Yue Lu, Shirong Cai, Yizheng Tu, Xinhui Zhou, Xiaomei Zhang, Yan Jiang, Christopher L Carroll, Zhijun Kang, Bin Liu, Jianjun Shen, Mihai Gagea, Sebastian M Manu, Lei Huo, Michael Gilcrease, Reid T Powell, Lei Guo, Clifford Stephan, Peter J Davies, Jan Parker-Thornburg, Guillermina Lozano, Richard R Behringer, Helen Piwnica-Worms, Jeffrey T Chang, Stacy L Moulder, Michelle Craig Barton

PMID34508101

期刊Nat Commun

发布时间2021-09-10

DOI10.1038/s41467-021-25650-z

来源查看原文

实验完整度

高

包含小鼠模型、原代细胞、PDX、人患者样本及多组学与功能验证

主要模型

Trim24COE小鼠（MMTV-Cre驱动乳腺上皮过表达Trim24） Trim24COE癌肉瘤原代细胞系（567、64、897）及对照细胞系823 人MpBC和非MpBC TNBC患者来源异种移植（PDX）肿瘤球人MpBC患者肿瘤样本（ARTEMIS队列，n=68）

重点核对

Trim24COE小鼠肿瘤发生率为46%，其中67%为癌肉瘤 Trim24COE小鼠乳腺中Trim24转录本表达较对照增加约2.5–3倍原代癌肉瘤细胞系567、64、897对Crizotinib、PHA-665752和Dactolisib的活力响应，对照4T1细胞不敏感 dTRIM24处理MpBC PDX肿瘤球（4例）均显著降低活力，非MpBC TNBC PDX中4例有2例响应人MpBC患者中核TRIM24高表达与较差5年总生存相关（p=0.04，n=47）

摘要

组蛋白阅读器Tripartite motif containing protein 24（TRIM24）在小鼠乳腺上皮中的条件性过表达（Trim24COE）驱动自发发生缺乏ER、PR和HER2的乳腺癌肉瘤。人癌肉瘤或化生性乳腺癌（MpBC）是三阴性乳腺癌（TNBC）中一种罕见、化疗难治的亚型。比较Trim24COE化生性癌肉瘤形态、TRIM24蛋白水平和衍生的Trim24COE基因特征，显示与人MpBC肿瘤及MpBC患者来源异种移植（PDX）模型高度相关。全局和单细胞肿瘤谱分析揭示Met是TRIM24的直接致癌靶点，导致异常的PI3K/mTOR激活。在此，我们发现药理学抑制这些通路在原发性Trim24COE肿瘤细胞中，以及TRIM24-PROTAC处理MpBC TNBC PDX肿瘤球，降低了细胞活力，提示靶向TRIM24及其调控通路在表达TRIM24的TNBC中具有治疗潜力。

建立Trim24条件过表达小鼠模型

验证乳腺上皮特异性过表达TRIM24是否足以诱导肿瘤发生。

通过piggyBac转座子将Floxed-Stop-mTrim24-Flag单拷贝整合到小鼠基因组，与MMTV-Cre小鼠杂交获得Trim24COE小鼠；观察乳腺增生、分支和肿瘤发生。

肿瘤病理分型和分子特征鉴定

确定Trim24COE肿瘤类型及其与人MpBC的相似性。

对Trim24COE小鼠乳腺肿瘤进行H&E和IHC（vimentin、E-cadherin、ER、PR、ERBB2、TRIM24等）；进行RNA-seq和通路分析；与人MpBC患者数据比较。

TRIM24直接调控Met的机制验证

验证TRIM24是否直接结合并激活Met表达。

在原代细胞系823（对照）和897（Trim24COE癌肉瘤）中进行ATAC-seq和ChIP-PCR；用tet-inducible shTrim24敲低Trim24后检测c-Met mRNA。

靶向Met-PI3K/mTOR通路的体外药物验证

评估抑制Met或PI3K/mTOR对Trim24COE癌肉瘤细胞活力的影响。

用Crizotinib、PHA-665752、Dactolisib处理原代癌肉瘤细胞系（567、64、897）和对照4T1细胞，72小时后检测细胞活力。

TRIM24降解剂在PDX肿瘤球中的效果评估

评估靶向TRIM24蛋白降解对MpBC PDX肿瘤球活力的影响。

用dTRIM24和阴性对照eTRIM24处理人MpBC和非MpBC TNBC PDX来源的肿瘤球，检测细胞活力。

实验环节	名称	品牌	货号
免疫组织化学	Flag抗体	Sigma	sc-7945
ER抗体	Santa Cruz	sc-8002
PR抗体	Abcam	ab63605
E-cadherin抗体	Proteintech	20874-1-AP
Vimentin抗体	Abcam	ab92547
人线粒体抗体	Chemicon	MAB1273
TRIM24抗体	Proteintech	14208-1-AP
染色质免疫沉淀	TRIM24抗体	Proteintech; Bethyl	14208-1-AP; A300-815A
Dynabeads蛋白A	Invitrogen	10002D
细胞培养	Lipofectamine 3000转染试剂	ThermoFisher Scientific	L3000008
对照shRNA	Horizon	RHS4743
Trim24 shRNA	Horizon	RMM4431-200368247
支原体检测试剂盒	Lonza	LT07218
RNA提取	TRIzol试剂	Invitrogen	--
RNA小量制备试剂盒	Zymo	R2050
RNA测序	TrueSeq RNA文库制备试剂盒v1	Illumina	--
全基因组测序	KAPA Hyperprep试剂盒	Roche	KK850
ATAC-seq	Nextera Tn5转座酶	Illumina	15027865
TD Tagment DNA缓冲液	Illumina	15027866
AMPure XP磁珠	Beckman Coulter	A63881
细胞活力检测	CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒	Promega	G7570
药物处理	克唑替尼	Cayman Chemical	12087
PHA-665752	Cayman Chemical	14703
Dactolisib	Cayman Chemical	21185
染色质免疫沉淀	微球菌核酸酶	Worthington	LS004798
ATAC-seq	DNA酶	Worthington	--

实验环节

名称

品牌

货号

免疫组织化学

Flag抗体

Sigma

sc-7945

ER抗体

Santa Cruz

sc-8002

PR抗体

Abcam

ab63605

E-cadherin抗体

Proteintech

20874-1-AP

Vimentin抗体

Abcam

ab92547

人线粒体抗体

Chemicon

MAB1273

TRIM24抗体

Proteintech

14208-1-AP

染色质免疫沉淀

TRIM24抗体

Proteintech; Bethyl

14208-1-AP; A300-815A

Dynabeads蛋白A

Invitrogen

10002D

细胞培养

Lipofectamine 3000转染试剂

ThermoFisher Scientific

L3000008

对照shRNA

Horizon

RHS4743

Trim24 shRNA

Horizon

RMM4431-200368247

支原体检测试剂盒

Lonza

LT07218

RNA提取

TRIzol试剂

Invitrogen

RNA小量制备试剂盒

Zymo

R2050

RNA测序

TrueSeq RNA文库制备试剂盒v1

Illumina

全基因组测序

KAPA Hyperprep试剂盒

Roche

KK850

ATAC-seq

Nextera Tn5转座酶

Illumina

15027865

TD Tagment DNA缓冲液

Illumina

15027866

AMPure XP磁珠

Beckman Coulter

A63881

细胞活力检测

CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒

Promega

G7570

药物处理

克唑替尼

Cayman Chemical

12087

PHA-665752

Cayman Chemical

14703

Dactolisib

Cayman Chemical

21185

染色质免疫沉淀

微球菌核酸酶

Worthington

LS004798

ATAC-seq

DNA酶

Worthington

环节	核对要点
Trim24COE小鼠模型建立与肿瘤监测	小鼠品系背景（FVB/NCr）、转基因整合方式（piggyBac单拷贝）、MMTV-Cre品系（Tg(MMTV-cre)4Mam，Jackson stock 003553）、肿瘤发生率（46%）和潜伏期（5–14个月）阅读提示：Methods 'Mouse model'；Results 'TRIM24 over-expression drives mammary gland tumorigenesis'；Fig. 1c
肿瘤病理分型和IHC标志物	肿瘤分类比例（腺瘤8%、癌25%、癌肉瘤67%）、IHC抗体来源和稀释比例（如Flag 1:5000、ER 1:500、PR 1:4000、E-cadherin 1:100、Vimentin 1:500、TRIM24 1:500）阅读提示：Methods 'Immunohistochemistry'；Fig. 2a,b；Supplementary Data 4
RNA-seq和通路分析	RNA-seq样本分组和数量（Trim24COE肿瘤n=6，对照n=4，非TRIM24肿瘤n=3）、差异表达基因筛选标准（FDR<5%，至少5倍变化）、ssGSEA和GSEA参数阅读提示：Methods 'RNA library preparation and deep-sequencing'和'RNA-seq analysis'；Fig. 3；Supplementary Data 6
Met启动子结合的ATAC-seq和ChIP-PCR	细胞系823和897、ATAC-seq建库方法（Omni-ATAC，50,000细胞）、ChIP-PCR引物位置（Met启动子−2.0 kb和−50 bp）、抗体（TRIM24 Proteintech 14208-1-AP；Bethyl A300-815A）阅读提示：Methods 'ATAC-seq library generation'、'ATAC-seq analysis'和'Chromatin immunoprecipitation'；Fig. 5b,c
药物处理细胞活力检测	细胞接种密度（2000细胞/孔，96孔板）、药物浓度（Crizotinib、PHA-665752、Dactolisib的浓度梯度文中未明确说明具体数值）、处理时间（72小时）、活力检测方法（CellTiter-Glo）阅读提示：Methods 'c-Met and PI3K/mTOR inhibitor treatment'和'Cell viability'；Fig. 5d；Supplementary Fig. 4b,d
TRIM24 PROTAC处理PDX肿瘤球	PDX模型来源和亚型（MpBC和non-MpBC TNBC）、药物浓度（dTRIM24和eTRIM24用于活力检测的浓度文中未明确说明，用于Western blot为4 μM）、处理时间（文中未明确说明，Western blot为48小时）、活力检测（CellTiter-Glo）阅读提示：Methods 'TRIM24 degrader treatment'；Fig. 7b；Supplementary Fig. 5e

环节

核对要点

Trim24COE小鼠模型建立与肿瘤监测

小鼠品系背景（FVB/NCr）、转基因整合方式（piggyBac单拷贝）、MMTV-Cre品系（Tg(MMTV-cre)4Mam，Jackson stock 003553）、肿瘤发生率（46%）和潜伏期（5–14个月）

阅读提示：Methods 'Mouse model'；Results 'TRIM24 over-expression drives mammary gland tumorigenesis'；Fig. 1c

肿瘤病理分型和IHC标志物

肿瘤分类比例（腺瘤8%、癌25%、癌肉瘤67%）、IHC抗体来源和稀释比例（如Flag 1:5000、ER 1:500、PR 1:4000、E-cadherin 1:100、Vimentin 1:500、TRIM24 1:500）

阅读提示：Methods 'Immunohistochemistry'；Fig. 2a,b；Supplementary Data 4

RNA-seq和通路分析

RNA-seq样本分组和数量（Trim24COE肿瘤n=6，对照n=4，非TRIM24肿瘤n=3）、差异表达基因筛选标准（FDR<5%，至少5倍变化）、ssGSEA和GSEA参数

阅读提示：Methods 'RNA library preparation and deep-sequencing'和'RNA-seq analysis'；Fig. 3；Supplementary Data 6

Met启动子结合的ATAC-seq和ChIP-PCR

细胞系823和897、ATAC-seq建库方法（Omni-ATAC，50,000细胞）、ChIP-PCR引物位置（Met启动子−2.0 kb和−50 bp）、抗体（TRIM24 Proteintech 14208-1-AP；Bethyl A300-815A）

阅读提示：Methods 'ATAC-seq library generation'、'ATAC-seq analysis'和'Chromatin immunoprecipitation'；Fig. 5b,c

药物处理细胞活力检测

细胞接种密度（2000细胞/孔，96孔板）、药物浓度（Crizotinib、PHA-665752、Dactolisib的浓度梯度文中未明确说明具体数值）、处理时间（72小时）、活力检测方法（CellTiter-Glo）

阅读提示：Methods 'c-Met and PI3K/mTOR inhibitor treatment'和'Cell viability'；Fig. 5d；Supplementary Fig. 4b,d

TRIM24 PROTAC处理PDX肿瘤球

PDX模型来源和亚型（MpBC和non-MpBC TNBC）、药物浓度（dTRIM24和eTRIM24用于活力检测的浓度文中未明确说明，用于Western blot为4 μM）、处理时间（文中未明确说明，Western blot为48小时）、活力检测（CellTiter-Glo）

阅读提示：Methods 'TRIM24 degrader treatment'；Fig. 7b；Supplementary Fig. 5e

大家都在搜

大家都在搜