构建PAK4-BirA*-GFP稳定细胞系并验证定位
建立可在体内进行邻近生物素标记的PAK4表达体系并确认其连接处定位。
在U2OS细胞中共转染pXJ-PAK4-BirA*-GFP与pBabe-puro，嘌呤霉素筛选单克隆，Western blot比较表达量，免疫荧光检测GFP与p120ctn定位。
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邻近蛋白质组学鉴定PAK4为Afadin-Nectin连接体的组分
Proximity proteomics identifies PAK4 as a component of Afadin-Nectin junctions.
实验完整度
高含U2OS/MDCK细胞系、SILAC-BioID邻近蛋白质组、免疫定位、siRNA敲低及磷酸化蛋白质组多层级功能与机制验证
主要模型
U2OS细胞系（PAK4-BirA*-GFP稳定表达） MDCK细胞系 MDCK 3D Matrigel囊肿培养
重点核对
PAK4-BirA*-GFP稳定株表达约高于内源PAK4 5倍且定位在细胞连接 PAK4-BirA*-GFP vs GFP-BirA*对照的SILAC-BioID比值>3.0筛选出27个邻近蛋白 Afadin BioID与PAK4邻近蛋白重叠>50% siRNA敲低Afadin（MDCK 72 h，约40%镶嵌丢失）导致PAK4从连接处丢失 磷酸化蛋白质组：5 μM PAK抑制剂处理12 min的SILAC比值变化
摘要
人PAK4是一种普遍表达的p21活化激酶，作用于Cdc42下游。由于PAK4富集于细胞-细胞连接处，我们探查了该激酶周围的局部蛋白质环境，以期了解其定位和底物。我们报道，表达PAK4-BirA-GFP的U2OS细胞鉴定出27个PAK4邻近蛋白的一个子集，它们主要是细胞-细胞连接组分。Afadin/AF6显示出最高的相对生物素标记，并与nectin家族同亲性连接蛋白相关联。反过来，超过50%的PAK4邻近蛋白被Afadin BioID鉴定到。共沉淀实验未能鉴定到连接蛋白，凸显了BioID方法的优势。机制上，PAK4的连接处定位依赖于Afadin，这与果蝇中的情况相似。一个排名靠前的PAK4邻近蛋白LZTS2在细胞-细胞连接处与Afadin共免疫定位。尽管PAK4和Cdc42位于连接处，BioID分析未检出经典钙黏蛋白，表明它们在空间上分离。为鉴定细胞PAK4底物，我们随后评估了用两种PAK抑制剂处理后磷酸化蛋白质组的快速变化（12分钟）。在PAK4邻近的连接蛋白中鉴定出17个PAK4位点。我们预期哺乳动物II组PAK对Afadin/nectin亚区室具有选择性，其定位与紧密连接和钙黏蛋白连接明显不同。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PAK4在哺乳动物细胞-细胞连接处的局部蛋白质环境、连接处定位依赖关系及其候选底物是什么。
- 核心机制
- PAK4定位于Afadin/nectin连接亚区室，其连接处定位依赖Afadin，并可能存在PAK4反馈维持Afadin的环路；该区室在空间上与钙黏蛋白连接分离。
- 主要证据
- U2OS PAK4-BirA*-GFP SILAC-BioID鉴定27个邻近蛋白（Afadin富集最高）；Afadin BioID重叠>50%；免疫荧光显示PAK4与Afadin共定位而与β-catenin/p120ctn分离；Afadin敲低使PAK4从连接处丢失；PAK抑制剂12 min磷酸化蛋白质组鉴定17个PAK4候选位点。
- 研究意义
- 提出哺乳动物II组PAK选择性作用于Afadin/nectin亚区室，并为其与紧密连接及钙黏蛋白连接定位不同提供依据，同时提供该位点的候选PAK4磷酸化底物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SILAC-BioID鉴定PAK4邻近蛋白
无偏鉴定PAK4周围约20 nm内的蛋白质环境。
PAK4-BirA*-GFP与GFP-BirA*对照细胞在重/轻同位素培养基中培养，加生物素标记，Neutravidin珠富集，SDS-PAGE与LC-MS/MS，按SILAC比值排序。
Afadin BioID及与PAK4邻近蛋白重叠分析
检验PAK4局部环境是否与Afadin一致。
进行BirA-Afadin BioID，提取特异性>2.0的数据集，与PAK4数据集比较重叠并构建亚复合物网络。
免疫定位比较PAK4与连接蛋白
验证PAK4与Afadin、ZO-1、β-catenin、p120ctn、LZTS2等的空间关系。
MDCK与U2OS细胞甲醇固定后免疫荧光，共聚焦成像；MDCK另做Matrigel 3D囊肿培养。
siRNA敲低Afadin或PAK4检测定位依赖
确定PAK4连接处定位是否依赖Afadin及是否存在反馈。
MDCK与U2OS细胞转染siRNA，48–72 h后固定免疫染色，共聚焦定量连接处荧光。
钙离子转换与肌动球蛋白抑制剂处理
检测连接重建及肌动球蛋白收缩对PAK4/Afadin连接定位的影响。
MDCK/U2OS钙去除后重建连接，加入Blebbistatin、Y-27632或PF3758309，免疫染色并定量双细胞/三细胞连接信号。
SILAC磷酸化蛋白质组鉴定PAK4候选底物
通过急性PAK抑制筛选PAK4依赖的磷酸化位点。
U2OS加PAK抑制剂12 min，尿素裂解、胰酶消化、Fe3+ IMAC富集磷酸肽，EASY-nLC 1000-Q-Exactive LC-MS/MS，MaxQuant分析SILAC比值。
合成肽体外磷酸化验证候选位点
验证PAK4对候选连接蛋白位点的直接磷酸化及序列偏好。
PepSPOT纤维素膜上合成肽，与重组His-PAK4cat和γ32P ATP孵育，放射自显影；并对PAK4 AID衍生肽进行丙氨酸扫描。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot/免疫荧光 | 兔PAK4抗体 | Proteintech | 14685-1-AP |
| 免疫荧光 | 小鼠p120-catenin抗体 | Santa Cruz | sc-23873 |
| 兔β-catenin抗体 | Cell Signaling | 9582S | |
| 小鼠β-catenin抗体 | Santa Cruz | sc-7963 | |
| 兔Afadin抗体 | Sigma | A0224 | |
| 小鼠Afadin抗体 | R&D Systems | MAB78291 | |
| 大鼠ZO-1抗体 | Santa Cruz | sc-33725 | |
| 兔LZTS2抗体 | Proteintech | 15677-1-AP | |
| 兔DLG5抗体 | Abcam | ab86783 | |
| 兔Scribble抗体 | Santa Cruz | sc-28737 | |
| Western blot | 兔p120-catenin pS320抗体 | Cell Signaling | 8016S |
| 小鼠β-tubulin抗体 | Sigma | T4026 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 |
| 驴抗小鼠Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-10036 | |
| 山羊抗大鼠Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11077 | |
| Western blot | 兔抗小鼠HRP | Dako | P0260 |
| 山羊抗兔HRP | Dako | P0448 | |
| 抑制剂处理 | PF-3758309 | -- | -- |
| Blebbistatin | Selleckchem | -- | |
| Y-27632 | Selleckchem | -- | |
| Frax597 | Selleckchem | -- | |
| SILAC培养 | SILAC培养基 | Thermo Scientific | -- |
| 透析胎牛血清 | Thermo Scientific | -- | |
| 重同位素L-赖氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| 重同位素L-精氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| BioID富集 | 高容量Neutravidin琼脂糖树脂 | Thermo Scientific | 29204 |
| 免疫共沉淀 | GFP-trap_A琼脂糖 | ChromoTek GmbH | -- |
| BioID标记 | D-生物素 | Invitrogen | -- |
| 转染 | TransIT X2转染试剂 | MirusBio | -- |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- | |
| Western blot | Immobilon ECL溶液 | Millipore | -- |
| 免疫荧光封片 | AquaPolymount封片剂 | Polysciences | -- |
| Vectashield H-1000封片剂 | Vectorlabs | -- | |
| 3D培养 | Matrigel基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 磷酸肽富集 | Fe3+ IMAC珠 | -- | -- |
| 质谱分析 | EASY-nLC 1000液相色谱 | Proxeon, Fisher Scientific | -- |
| Q-Exactive混合四极杆-轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EASY-Spray色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 体外激酶实验 | PepSPOTs肽膜 | JPT Peptide Technologies GmbH | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap XL质谱仪 | Thermo Fisher | -- |
| 胰酶消化 | 测序级胰蛋白酶 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PAK4-BirA*-GFP稳定细胞系与BioID | 稳定株表达约高于内源PAK4 5倍；biotin 100 μM标记5 h；SILAC比值>3.0且peptides>2；两次独立SILAC-BioID MS实验 阅读提示：Methods中Generation of stable cell lines、Affinity capture of biotinylated proteins、SILAC；Fig. 1及Table 1 |
| Afadin BioID重叠分析 | Afadin数据集特异性>2.0；PAK4重叠分析SILAC ratio >2.5；16/27重叠比例 阅读提示：Results中Significant overlap between Afadin- and PAK4-proximal proteins；Fig. 2b；Supplementary Dataset T1 |
| siRNA敲低与连接定位 | siRNA终浓度50 nM；MDCK 72 h、约40%镶嵌丢失；定量为20 cells over 2 independent replicates，two-tailed unpaired t-test 阅读提示：Methods中Cell-line knockdown with siRNA；Fig. 5a,b；Fig. S4 |
| 钙离子转换与抑制剂处理 | 5 mM EGTA 45 min；1.8 mM钙复贴45 min；Blebbistatin 25 µM、Y-27632 10 µM、PF3758309 5 µM处理2–4 h 阅读提示：Methods中Calcium switch, inhibitor treatment and 3D culture；Fig. 5c,d；Fig. S5、S6 |
| 磷酸化蛋白质组 | PAK抑制剂5 μM处理12 min；SILAC正向与反向实验；FDR 0.01；17个PAK4候选位点 阅读提示：Methods中Phospho-proteomic sample preparation、Phospho-peptide analysis；Fig. 6；Table 2 |
| 合成肽体外激酶实验 | 重组100 nM His-PAK4cat；25 μM ATP含1 μCi γ32P ATP；30 °C 30 min；32个合成肽中17个可检测磷酸化 阅读提示：Methods中In vitro kinase assay on synthetic PAK4 pseudosubstrate peptide spots；Fig. 7 |