GWAS、mQTL与eQTL整合及共定位
优先确定16号染色体位点的候选基因及其共享因果变异
整合eGFR GWAS、人肾mQTL（n=188）、肾小管（n=121）与肾小球（n=119）eQTL，并进行moloc共定位分析
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单个遗传位点通过铁死亡同时调控DPEP1/CHMP1A的表达和肾脏疾病的发生发展
A single genetic locus controls both expression of DPEP1/CHMP1A and kidney disease development via ferroptosis.
实验完整度
高含GWAS/mQTL/eQTL整合、人肾snATAC-seq、CRISPR编辑、Dpep1与Chmp1a小鼠模型、细胞siRNA及铁死亡功能验证
主要模型
人肾小管与肾小球eQTL/mQTL样本（n=188、121、119） HEK293细胞CRISPR/Cas9开放染色质区缺失 Dpep1+/−、Dpep1−/−与Chmp1a+/−小鼠 NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞与原代肾小管上皮细胞
重点核对
Dpep1+/−小鼠顺铂25 mg/kg腹腔注射、第3天取材，FA 250 mg/kg第7天取材 Chmp1a+/−小鼠顺铂20 mg/kg、FA 200 mg/kg腹腔注射 NRK-52E细胞siRNA转染50 nM，顺铂20 μM处理24 h 铁死亡/凋亡/坏死性凋亡/焦亡抑制剂预处理浓度与时间（Nec-1 20 μM、Liproxstatin1 1 μM、VX-765 10 μM、Z-VAD(OMe)-FMK 20 μM，18 h） Chmp1a+/−小鼠体内liproxstatin注射验证铁死亡
摘要
全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出肾脏疾病的易感位点，但其因果变异、基因及通路仍不清楚。本文通过整合肾功能GWAS、人肾表达数量性状位点及甲基化数量性状位点，鉴定出两个肾脏疾病基因——二肽酶1（DPEP1）和带电多囊体蛋白1A（CHMP1A）。利用单细胞染色质可及性和基因组编辑技术，我们精细定位了同时控制这两个基因表达的区域。小鼠遗传模型证明了这两个基因在肾脏疾病中的因果作用。细胞研究表明，Dpep1和Chmp1a均是单一通路——铁死亡的重要调控因子，并通过改变细胞铁转运导致肾脏疾病发生。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 16号染色体肾功能GWAS位点（rs164748）的因果变异、靶基因及其导致肾脏疾病的分子通路是什么。
- 核心机制
- 单一精细定位的遗传位点共同调控DPEP1和CHMP1A表达；DPEP1影响铁导入、CHMP1A影响铁外排（外泌体形成），二者经相反方向调控铁死亡从而影响肾损伤。
- 主要证据
- GWAS/mQTL/eQTL共定位（PP_abc=0.92）、人肾snATAC-seq与CRISPR/Cas9缺失（DPEP1升高、CHMP1A降低）、Dpep1与Chmp1a小鼠在顺铂/FA/UUO模型中的损伤表型、细胞中脂质过氧化、铁含量、ACSL4及铁死亡激活剂/抑制剂实验。
- 研究意义
- 表明单个位点可经共同调控区控制多个靶基因，铁死亡是肾功能遗传调控的关键通路，靶向Dpep1或Chmp1a相关铁死亡可能为肾脏疾病提供治疗方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
人肾单核ATAC-seq精细定位与条件分析
确定位点内功能性开放染色质区域及可能因果变异
分析人肾snATAC-seq（2例健康肾、12,720核）和小鼠snATAC-seq（3例、16,887核），结合H3K27ac/H3K4me1/H3K4me3 ChIP-seq及GCTA条件分析
CRISPR/Cas9开放染色质区缺失
验证候选调控区对DPEP1和CHMP1A表达的作用
在稳定表达Cas9的HEK293细胞中转染sgRNA表达质粒，缺失优先区域，72 h后检测DPEP1和CHMP1A表达并用Sanger测序确认
Dpep1与Chmp1a小鼠模型损伤表型
验证两个基因在肾脏疾病中的因果作用
构建Dpep1敲除小鼠并导入Chmp1a+/−小鼠，在顺铂、叶酸及单侧输尿管结扎模型中评估BUN、肌酐、组织学及损伤/纤维化标志物
细胞水平铁死亡机制验证
确定Dpep1和Chmp1a是否经铁死亡调控肾小管细胞死亡
NRK-52E及原代肾小管上皮细胞中转染siRNA或过表达质粒，检测LDH、活死细胞比、BODIPY 581/591 C11脂质过氧化、MitoSOX、铁含量、ACSL4及铁死亡激活剂/抑制剂反应
人肾样本中铁死亡基因相关性分析
在人肾组织中验证DPEP1/CHMP1A与铁死亡基因的关系
分析432例显微切割人肾小管RNA-seq，计算DPEP1/CHMP1A与铁死亡基因表达相关性，并检测CKD样本ACSL4蛋白
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠基因编辑 | Cas9 mRNA | ThermoFisher | A29378 |
| sgRNA体外转录 | Guide-it sgRNA体外转录试剂盒 | Takara | 632635 |
| 血清肌酐检测 | 肌酐酶法及肌酐标准品 | DIAZYME | DZ072B-KY1 |
| 血清尿素氮检测 | Infinity尿素液体稳定试剂 | Pointe Scientific | B7552150 |
| 组织学染色 | 天狼星红 | Polyscience | 24901 |
| 细胞培养 | Lipofectamine 3000转染试剂 | -- | -- |
| Dpep1过表达 | pCMV6-Entry载体 | OriGene Technologies, Inc. | -- |
| 坏死性凋亡抑制 | 坏死性凋亡抑制剂Nec-1 | Cayman | 11658 |
| 铁死亡抑制 | 铁死亡抑制剂Liproxstatin1 | Cayman | 17730 |
| 焦亡抑制 | 焦亡抑制剂VX-765 | Cayman | 28825 |
| 顺铂处理 | 顺铂 | Cayman | 15663-27-1 |
| Nlrp3激活 | 尼日利亚菌素 | Sigma | N7143 |
| 凋亡诱导 | 喜树碱 | Cayman | 11694 |
| 铁死亡诱导 | 铁死亡诱导剂erastin | Cayman | 17754 |
| 铁死亡诱导剂FIN56 | Cayman | 25180 | |
| 铁死亡诱导剂FINO2 | Cayman | 25096 | |
| 铁死亡诱导剂RSL3 | Cayman | 19288 | |
| 原代细胞分离 | I型胶原酶 | Gibco | 17018-029 |
| 原代细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Corning | 10-040-CM |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11950 | |
| 表皮生长因子 | Peprotech | AF-100-15 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂 | Gibco | 51500-056 | |
| 青霉素-链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| 线粒体ROS抑制 | 线粒体ROS抑制剂Mito-TEMPO | Sigma | SML0737 |
| 细胞裂解 | 裂解缓冲液 | CST | 9806 |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836153001 |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | 4906837001 | |
| DPEP1抗体 | Proteintech | 12222-1-AP | |
| CHMP1A抗体 | Proteintech | 15761-1-AP | |
| RIPK3抗体 | Sigma | PRS2283 | |
| cleaved Caspase 1抗体 | Santa cruz | sc-56036 | |
| III型胶原抗体 | Abcam | ab7778 | |
| 纤连蛋白抗体 | Abcam | ab2413 | |
| α平滑肌肌动蛋白抗体 | Sigma | A5228 | |
| ACSL4抗体 | Abcam | ab155282 | |
| CD63抗体 | Abcam | ab193349 | |
| GPX4抗体 | Abcam | ab125066 | |
| 肌动蛋白抗体 | Sigma | A3854 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 微管蛋白抗体 | BioLegend | 801202 | |
| 抗兔IgG（H+L）（DyLight 800 4X PEG偶联） | CST | 5151 | |
| 抗小鼠IgG（H+L）（DyLight 680偶联） | CST | 5470 | |
| 免疫荧光 | cleaved Caspase 3抗体 | CST | 9664 |
| 荧光素标记LTL | Vector | FL-1321 | |
| AQP2抗体 | Santa Cruz | sc-9882 | |
| 荧光素标记DBA | Vector | FL-1031-5 | |
| 荧光素标记PNA | Vector | FL-1071-5 | |
| DPEP1抗体 | Invitrogen | PA5-52984 | |
| EEA1抗体 | BD | 610456 | |
| RAB5抗体 | CST | 3547 | |
| RAB7抗体 | Sigma | R8779 | |
| RAB11抗体 | BD | 610658 | |
| VAMP7抗体 | NOVUS | NBP1-07118 | |
| GM130抗体 | BD | 610822 | |
| 活细胞成像 | 转铁蛋白 | Thermo Fisher | T13342 |
| 线粒体超氧化物荧光探针 | ThermoFisher | M36008 | |
| BODIPY 581/591 C11脂质过氧化探针 | Thermo Fisher | D3861 | |
| 488偶联葡聚糖 | Thermo Fisher | D22910 | |
| 细胞活性检测 | 台盼蓝 | Thermo Fisher | T10282 |
| 细胞计数 | Countess自动细胞计数仪 | Invitrogen | C10227 |
| 细胞毒性检测 | CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒 | Promega | G1780 |
| 活死细胞检测 | MultiTox-Fluor多重细胞毒性检测试剂盒 | Promega | 9201 |
| TUNEL检测 | Click-iT Plus TUNEL原位凋亡检测试剂盒（Alexa Fluor 594） | ThermoFisher Scientific | C10618 |
| 谷胱甘肽检测 | 谷胱甘肽比色检测试剂盒 | Invitrogen | EIAGSHC |
| 铁含量检测 | 铁比色检测试剂盒 | BioVision | K390-100 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GWAS/mQTL/eQTL整合与共定位 | mQTL样本n=188；eQTL肾小管n=121、肾小球n=119；moloc窗口±100 kb，PP_abc阈值为0.8；eGFR GWAS显著性P<5.0E−8 阅读提示：Methods“GWAS, eQTL, mQTL, and moloc analysis”及Fig. 1 legend |
| 人肾snATAC-seq与条件分析 | 人肾snATAC-seq 2例、12,720核，小鼠3例、16,887核；12个开放染色质区逐一条件分析；Peaks 2和7无可用SNP 阅读提示：Methods“Single-cell ATAC sequencing”“Conditional analysis”及Fig. 2 legend |
| CRISPR/Cas9开放染色质区缺失 | HEK293稳定表达Cas9细胞；sgRNA质粒转染后72 h检测；每组n=4；sgRNA序列见Supplementary Data 5 阅读提示：Methods“CRISPR/Cas9 mediated peak deletion”及Fig. 2c legend |
| 小鼠肾损伤模型 | 8–10周龄雄性小鼠；顺铂25 mg/kg（Chmp1a+/−为20 mg/kg）第3天取材；FA 250 mg/kg（Chmp1a+/−为200 mg/kg）第7天取材；UUO第7天取材；各模型每组n=3至n=7 阅读提示：Methods“Mice”及Fig. 3、Fig. 4、Fig. 5图注 |
| 细胞转染与处理 | NRK-52E细胞；siRNA终浓度50 nM、过表达质粒5 μg；顺铂20 μM处理24 h；铁死亡激活剂及抑制剂浓度与处理时间 阅读提示：Methods“Cell culture”及Fig. 4–Fig. 7图注 |
| 体内liproxstatin验证 | Chmp1a+/−小鼠顺铂联合liproxstatin注射的分组与剂量：文中未明确说明Liproxstatin给药剂量 阅读提示：Fig. 7h、i legend及Methods“Cell culture”中抑制剂浓度 |
| 人肾样本相关性分析 | 显微切割人肾小管RNA-seq n=432；临床信息见Supplementary Data 3；Pearson相关分析及统计方法 阅读提示：Methods“Human kidney RNA-seq data”及Fig. 8 legend |