食管癌蛋白质组与磷酸化蛋白质组图谱构建
系统鉴定EC中失调的蛋白质、磷酸化位点和通路。
对124对EC肿瘤及癌旁组织进行TMT 11-plex蛋白质组分析；对31对样本进行无标记磷酸化蛋白质组分析；进行PCA、层次聚类和批次效应评估；差异表达和通路富集分析。
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大规模高分辨率质谱蛋白质组学分析定义食管癌分子亚型以指导治疗靶向
Large-scale and high-resolution mass spectrometry-based proteomics profiling defines molecular subtypes of esophageal cancer for therapeutic targeting.
实验完整度
高包含蛋白质组/磷酸化蛋白质组队列分析、细胞系功能实验、皮下移植瘤模型及患者组织IHC验证等多个独立证据层级。
主要模型
124对食管癌及癌旁组织（队列1） 295例食管癌患者组织芯片（队列2） 食管鳞癌细胞系KYSE30、KYSE150、KYSE450、TE1、TE3、TE5 KYSE30和KYSE150皮下移植瘤裸鼠模型
重点核对
TMT 11-plex标记：124对样本分为25组，每组5对肿瘤/癌旁，131C为内参 无标记磷酸化蛋白质组：31对肿瘤/癌旁组织 共识聚类：Prot5中变异最大的前25%（1617个蛋白），k=2，1000次重复 药物验证浓度与给药：Sulconazole 50 μM、Menadione 20 μM、GW8510 15 μM处理24 h；小鼠腹腔注射GW8510 5 mg/kg、Menadione 10 mg/kg、Sulconazole 10 mg/kg，每3天一次 诊断模型：SVM分类器，五折交叉验证重复100次，独立队列IHC验证（n=295）
摘要
食管癌（EC）是一种缺乏临床相关分子亚型的侵袭性癌症，阻碍了有效治疗策略的开发。为定义EC的分子亚型，我们对EC肿瘤及癌旁非肿瘤组织进行了基于质谱的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，揭示了一系列在EC中失调的蛋白质和磷酸化位点。基于蛋白质组学分析，EC队列被分层为两个分子亚型——S1和S2，其中S2亚型以剪接体和核糖体蛋白上调为特征，且更具侵袭性。此外，我们鉴定了一个由ELOA和SCAF4组成的亚型特征，并构建了亚型诊断和预后模型。针对S2亚型患者的潜在药物被预测，并验证了三种候选药物可抑制EC。综上，我们的蛋白质组学分析定义了EC的分子亚型，从而为改善EC患者的疾病结局提供了潜在的治疗前景。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否基于大规模蛋白质组学分析定义食管癌的临床相关分子亚型，并据此开发诊断、预后模型及治疗策略。
- 核心机制
- S2亚型中剪接体和核糖体蛋白上调，mRNA加工、DNA复制、DNA修复、E2F靶点和G2/M检查点通路活性从非肿瘤到S1到S2逐渐增强，可能与S2恶性表型相关；剪接体蛋白（如SR蛋白）在肿瘤中高度磷酸化。
- 主要证据
- 124对EC肿瘤/癌旁组织的TMT蛋白质组和31对组织的磷酸化蛋白质组分析定义S1/S2亚型；S2亚型OS和DFS更差；ELOA/SCAF4诊断模型在独立295例IHC队列中验证；GW8510、Menadione、Sulconazole在EC细胞系和移植瘤模型中抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 定义了EC的蛋白质组分子亚型，提供了可用于临床分层的诊断和预后模型，并为更具侵袭性的S2亚型患者预测和验证了潜在治疗药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白质组分子亚型定义与临床关联分析
基于蛋白质组数据将EC患者分层为临床相关分子亚型。
对Prot5中变异最大的前25%蛋白进行共识聚类，确定S1和S2两个亚型；比较两亚型OS和DFS；分析亚型与临床病理因素的相关性；比较S2与S1差异蛋白和磷酸化位点。
亚型诊断特征鉴定与诊断模型构建
鉴定可用于临床的亚型诊断特征并构建诊断模型。
以S2 vs S1差异蛋白为初始特征集，使用SVM进行特征选择（最大特征数1-4，重复100次）；选择ELOA和SCAF4作为诊断特征；构建SVM诊断模型；在独立队列2（n=295）中通过IHC验证。
亚型预后模型构建与评估
结合分子亚型和pTNM分期改善EC患者预后分层。
构建以亚型和pTNM分期为自变量的Cox PH模型（pTNM+Subtype）；通过k-means聚类（k=3）构建pTNM+Subtype 3c模型；使用时间依赖ROC曲线评估预后性能。
基于分子亚型的药物预测与体外验证
为EC患者特别是S2亚型预测并验证潜在治疗药物。
以S1/S2差异且与OS显著相关的蛋白为查询特征映射至CMAP预测候选药物；在6种EC细胞系中检测候选药物对细胞活力的影响；通过集落形成实验验证GW8510、Menadione和Sulconazole的效果。
候选药物体内抗肿瘤效果验证
在动物模型中验证候选药物对EC肿瘤生长的抑制作用。
使用KYSE30和KYSE150细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，腹腔注射GW8510、Menadione或Sulconazole，监测肿瘤体积和重量。
药物作用与亚型差异蛋白关联的蛋白质组学分析
探究候选药物对S1/S2亚型差异表达蛋白的调控作用。
对经GW8510、Menadione或Sulconazole处理的KYSE150细胞进行蛋白质组学分析，比较药物处理前后S2上调/下调蛋白的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白质组与磷酸化蛋白质组分析
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质组学标记 | TMT 11-plex标记试剂盒 | Pierce | -- |
| 磷酸肽富集 | High-Select Fe-NTA磷酸肽富集试剂盒 | Thermo Scientific | A32992 |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 药物处理 | 硝酸舒康唑 | MedChem Express | HY-B1460A |
| 甲萘醌 | MedChem Express | HY-B0332 | |
| GW8510 | Santa Cruz Biotechnology | sc-215122 | |
| 细胞活力检测 | MTS检测试剂 | Promega | G3581 |
| 免疫组化 | 兔抗ELOA多克隆抗体 | Novus | NBP1-87040 |
| SCAF4多克隆抗体 | Thermo fisher | PA5-36611 | |
| MX1多克隆抗体 | Proteintech | 13750-1-AP | |
| 兔抗OAS3多克隆抗体 | Proteintech | 21915-1-AP | |
| 鼠抗IFIT1单克隆抗体 | Origene | TA500948S | |
| Western blot | β-肌动蛋白单克隆抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig |
| 蛋白质组学样品制备 | Lys-C蛋白酶 | Wako | -- |
| 胰蛋白酶 | Promega | -- | |
| Sep-Pak tC18固相萃取柱 | Waters | -- | |
| Waters XBridge BEH C18色谱柱 | Waters | -- | |
| Ultimate 3000高效液相色谱系统 | Dionex | -- | |
| 蛋白质组学质谱分析 | Orbitrap Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY-nLC 1200超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| nanoU3000超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞活力检测 | MK3酶标仪 | Thermo Scientific | -- |
| Western blot | Laemmli样品缓冲液 | Bio-Rad | -- |
| Chemodoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 集落形成实验 | ChemiDoc Touch凝胶成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白质组学样本分组与标记 | 124对样本分为25组TMT 11-plex，每组5对肿瘤/癌旁，131C为内参；肿瘤标记127N、128N、129N、130N、131N，癌旁标记126、127C、128C、129C、130C 阅读提示：Methods中TMT 11-plex labeling小节及Fig. 1a |
| 分子亚型定义 | 共识聚类参数：maxK=6、reps=1000、pItem=0.8、pFeature=0.8、clusterAlg=hc、distance=spearman；Prot5中变异最大的前25%（1617个蛋白） 阅读提示：Methods中Consensus clustering for proteomic data小节及Fig. 3a、b |
| 亚型诊断模型构建与验证 | SVM分类器参数：sfs、Subsample重采样50次、性能指标AUC；五折交叉验证重复100次；独立队列2 n=295 IHC验证 阅读提示：Methods中Signature identification、Signature evaluation、Construction of subtype diagnostic model小节及Fig. 4 |
| 候选药物体外验证 | 细胞系KYSE30、KYSE150、KYSE450、TE1、TE3、TE5；药物浓度Sulconazole 50 μM、Menadione 20 μM、GW8510 15 μM；处理24 h；MTS检测492 nm；集落形成实验每孔500细胞 阅读提示：Methods中Cell viability assay和Colony formation assay小节及Fig. 5c、d |
| 候选药物体内验证 | 裸鼠3-5周龄，每组n=5；KYSE30接种2×10^6、KYSE150接种1×10^6细胞；肿瘤体积达50 mm^3开始给药；GW8510 5 mg/kg、Menadione 10 mg/kg、Sulconazole 10 mg/kg腹腔注射每3天一次；30天后处死 阅读提示：Methods中Xenograft assay in nude mice小节及Fig. 5e–h |