构建C9ORF72剪接报告系统
在含内含子背景下可视化并区分前体mRNA、剪接内含子和成熟mRNA。
构建含70×GGGGCC重复序列的C9ORF72内含子1剪接报告基因，插入24×MBS和24×PBS，稳定转染U-2 OS细胞，并通过RT-PCR和纳米孔测序验证剪接正确性。
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C9ORF72-ALS/FTD中环形含重复序列内含子RNA的核输出与翻译
Nuclear export and translation of circular repeat-containing intronic RNA in C9ORF72-ALS/FTD.
实验完整度
高含报告细胞系、患者来源细胞、活细胞成像、RNase R、体外翻译及siRNA敲低等多层级功能与机制验证
主要模型
U-2 OS细胞系稳定表达C9ORF72剪接报告基因 C9ORF72-ALS患者来源成纤维细胞 C9ORF72-ALS患者来源iPSC分化的运动神经元 HeLa Flp-In双荧光素酶报告细胞系
重点核对
报告基因中(GGGGCC)70重复序列位于C9ORF72内含子1，并插入24×MBS和24×PBS以区分前体mRNA、剪接内含子和成熟mRNA smFISH使用分别靶向MBS（内含子）和PBS（外显子）的探针组，以共定位阈值200 nm判定共定位 RNase R处理（37°C 15 min，1 U/50 µL）用于区分环形RNA与线性RNA NXF1或NXT1 siRNA转染（25 nM，3天后 harvest）用于敲低核输出通路 患者来源iPSN在分化第16天转染siRNA，第32天通过ELISA检测poly-GP
摘要
C9ORF72六核苷酸GGGGCC重复扩增是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）最常见的遗传病因。含重复序列的RNA通过核内颗粒和由重复序列关联的非AUG翻译（RAN翻译）产生的二肽重复（DPR）蛋白介导毒性。然而，内含子定位的重复序列如何被输出并在细胞质中翻译仍不清楚。我们采用单分子成像方法检测重复RNA的分子身份和时空动态。我们证明，含G富集重复序列的剪接内含子由于套索去分支缺陷而以环形形式稳定存在。剪接后的环形内含子而非前体mRNA作为翻译模板。NXF1-NXT1通路在环形内含子的核输出中起重要作用，并调节毒性DPR的产生。本研究揭示了一种由重复扩增介导的未表征的致病RNA种类，并证明RNA空间定位对理解疾病病因学的重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- C9ORF72内含子定位的GGGGCC重复序列以何种RNA分子身份被输出至细胞质并作为RAN翻译模板，以及其核输出机制是什么。
- 核心机制
- 含G富集重复序列的剪接内含子因套索去分支缺陷而以环形形式稳定存在，该环形内含子通过NXF1-NXT1通路输出至细胞质，并作为不依赖5′帽的RAN翻译模板产生DPR蛋白。
- 主要证据
- 单分子成像显示细胞质中含重复序列的内含子主要为剪接后内含子且对RNase R抵抗；SINAPS检测到翻译位点与环形内含子共定位；NXF1敲低减少细胞质内含子及RAN翻译产物；患者iPSN中NXF1/NXT1敲低降低poly-GP水平。
- 研究意义
- 揭示了一种由重复扩增介导的致病RNA种类，证明RNA空间定位对理解疾病病因学的重要性，并为治疗靶点设计提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
smFISH分析RNA空间分布
确定含重复序列的内含子是否形成核内颗粒并被输出至细胞质。
使用靶向MBS和PBS的双色smFISH探针，定量细胞核与细胞质中不同RNA种类的数目和共定位情况；并用放线菌素D处理排除转录影响。
患者来源细胞验证内源性RNA分布
验证内源性C9ORF72重复RNA在患者细胞中的空间分布与分子身份。
在C9ORF72-ALS患者成纤维细胞和淋巴母细胞中进行smFISH，使用靶向内含子1和外显子的探针组，并以C9-ASO敲低验证探针特异性。
RNase R处理鉴定环形内含子
确定细胞质中含重复序列的内含子是否为环形RNA。
在固定细胞中保留RNase R活性进行smFISH，比较处理前后内含子和外显子信号变化；并通过RT-PCR和深度测序鉴定分支点-5′剪接位点连接。
测试不同重复序列对内含子稳定和输出的影响
探究G富集重复序列是否特异地稳定剪接内含子并介导核输出。
将(GGGGCC)70替换为(CCTG)240、(ATTCT)73、(CCCCGG)70或(CGG)98，构建稳定细胞系，smFISH定量细胞质内含子和外显子数目。
单分子翻译成像检测RAN翻译
验证剪接内含子是否作为RAN翻译模板。
在报告基因中插入24×SunTag表位，利用SINAPS技术检测翻译位点与内含子RNA的共定位；用嘌呤霉素处理验证翻译信号特异性；并用亚砷酸钠处理检测应激对翻译的影响。
体外翻译验证不依赖5′帽的RAN翻译
验证(GGGGCC)70 RAN翻译可不依赖5′帽结构起始。
构建双顺反子报告RNA，第一开放阅读框为帽依赖翻译，第二顺反子NLuc无ATG起始密码子，融合于(GGGGCC)70下游，体外转录后在家兔网状红细胞裂解物中翻译并检测NLuc活性。
NXF1-NXT1通路调控核输出验证
验证NXF1-NXT1通路是否介导环形内含子的核输出并影响DPR产生。
siRNA敲低NXF1或NXT1，smFISH定量细胞质内含子和外显子数目；双荧光素酶报告检测RAN翻译活性；患者iPSN中敲低后ELISA检测poly-GP水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma–Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | Sigma–Aldrich | -- | |
| 链霉素 | Sigma–Aldrich | -- | |
| 稳定细胞系筛选 | 潮霉素 | -- | -- |
| 转染 | TransIT-LT1转染试剂 | Mirus Bio | -- |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| siRNA敲低 | NXF1 ON-TARGETplus混合siRNA | GE Dharmacon | L-013680-01-0005 |
| NXT1 siRNA | GE Dharmacon | L-017194-00-0005 | |
| 非靶向对照siRNA | GE Dharmacon | D-001810-10-05 | |
| ASO敲低 | 靶向C9ORF72的反义寡核苷酸 | -- | -- |
| Western blot | NXF1抗体 | Bethyl Laboratories | #A300-914A |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | #3700 | |
| 山羊抗小鼠IgG HRP偶联二抗 | GE healthcare | #NA934V | |
| 山羊抗兔IgG HRP偶联二抗 | GE healthcare | #NA934V | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| RQ1 DNase I | Promega | -- | |
| 逆转录 | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368813 |
| qPCR | Power Up SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | A25776 |
| TaqMan快速进阶预混液 | Applied Biosystems | 4444557 | |
| RNase R处理 | RNase R | Lucigen | RNR07250 |
| RNA纯化 | Quick-RNA微量制备试剂盒 | Zymo research | R1050 |
| 体外转录 | MEGAscript T7转录试剂盒 | Ambion | AM1333 |
| 体外翻译 | Flexi兔网状红细胞裂解物系统 | Promega | L4540 |
| 荧光素酶检测 | Nano-Glo双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| 纳米孔测序 | NEBNext Poly(A) mRNA磁力分离模块 | New England Biolabs | E7490L |
| 直接RNA测序试剂盒 | Oxford Nanopore Technologies | SQK-RNA002 | |
| GridION流动池 | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN106 | |
| MiSeq测序 | TGIRT-III逆转录酶 | InGex | TGIRT10 |
| Phusion高保真DNA聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| GeneJET凝胶回收试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K0692 | |
| smFISH | Cy3 NHS酯 | Lumiprobe | 11020 |
| Cy5 NHS酯 | Lumiprobe | 13020 | |
| Cy7 NHS酯 | Lumiprobe | 15020 | |
| 细胞培养 | 大鼠尾胶原I | Gibco | 2052954 |
| smFISH封片 | 含DAPI的ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36962 |
| smFISH-IF | sfGFP一抗 | Aves Labs | GFP-1010 |
| 山羊抗鸡IgY (H+L) Alexa Fluor 647二抗 | Thermo Fisher Scientific | A21449 | |
| 活细胞成像 | JF646 Halo染料 | -- | -- |
| Leibovitz L-15培养基 | -- | -- | |
| 细胞成像 | TetraSpec微球 | Thermo Fisher | T7279 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 报告基因构建与验证 | 重复序列长度（70×GGGGCC）、MBS/PBS插入位置、细胞系（U-2 OS）、剪接验证方法（RT-PCR和纳米孔测序） 阅读提示：Methods中Plasmids和Nanopore sequencing小节；Supplementary Fig. 1–3 |
| smFISH检测RNA分布 | 探针浓度（50–100 nM）、杂交时间（37°C 3小时）、共定位阈值（200 nm）、放线菌素D处理条件（1 μg/mL，20分钟） 阅读提示：Methods中RNA smFISH and immunofluorescence小节；Fig. 1图注 |
| RNase R处理鉴定环形RNA | RNase R浓度（1 U/50 µL）、处理时间（37°C 15分钟）、固定方式（甲醇-乙酸4:1，−20°C 20分钟） 阅读提示：Methods中RNA smFISH and immunofluorescence小节；Fig. 3图注 |
| NXF1-NXT1敲低实验 | siRNA浓度（25 nM）、收集时间（3天后）、细胞系（U-2 OS报告细胞）、检测指标（细胞质内含子数目和DPR水平） 阅读提示：Methods中Cell culture and transfection小节；Fig. 6图注 |
| 患者iPSN实验 | iPSN分化方案（18天diMN协议）、siRNA转染时间（第16天）、poly-GP ELISA检测时间（第32天）、细胞系信息（Supplementary Table 1） 阅读提示：Methods中iPSN differentiation, transfection, and poly-GP ELISA小节；Fig. 6d |