建立Trp53缺失claudin-low乳腺肿瘤原代细胞系
获得可用于三维类器官培养的间充质乳腺肿瘤细胞模型
从Trp53缺失GEM乳腺肿瘤中分离原代细胞，利用工程化新霉素抗性基因以G418筛选去除基质细胞，并检测支原体污染
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对间充质乳腺肿瘤类器官进行形态学筛选以鉴定逆转上皮-间充质转化的药物
Morphological screening of mesenchymal mammary tumor organoids to identify drugs that reverse epithelial-mesenchymal transition.
实验完整度
高涵盖二维细胞系、三维类器官形态筛选及小鼠移植瘤体内验证，并含蛋白、RNA、报告基因等多层功能与机制验证
主要模型
Trp53缺失claudin-low乳腺肿瘤原代细胞系T11和T12 T11和T12三维Matrigel类器官 BALB/c小鼠T12肿瘤乳腺脂肪垫移植模型
重点核对
T11和T12类器官中dox诱导miR-200c（1 μg/ml）作为EMT逆转阳性对照，DMSO为阴性对照，无细胞培养基孔为毒性对照 表观遗传药物库在四个浓度、两个独立生物学重复下筛选，处理5天后进行明场z-stack成像 候选药物以10个浓度半对数梯度、技术四重复进行剂量-反应验证，并以PR50评价效力 处理终点用CellTiter-Glo 3D检测ATP水平作为细胞活力对照，以区分重编程与细胞毒性 体内实验：T12细胞2.5×10^4移植后第9天给药，Azacytidine 0.5 mg/kg、Mocetinostat 5 mg/kg、Carboplatin 50 mg/kg每周腹腔注射，每组n=5
摘要
上皮-间充质转化（EMT）被认为赋予癌细胞干细胞特性和治疗耐药性。因此，鉴定能够重编程EMT的药物可能提供新的治疗策略。在本研究中，我们报道来源于claudin-low乳腺肿瘤（三阴性乳腺癌的一种间充质亚型）的细胞在三维基质中表现出带有延伸"尖刺"的独特类器官结构。在miR-200诱导的间充质-上皮转化（MET）后，类器官转变为更光滑的圆形形态。基于这些观察，我们开发了一种形态学筛选方法及配套的分析流程，利用深度神经网络和最近邻分类来筛选逆转EMT的药物。通过对一个靶向表观遗传药物库的筛选，我们鉴定了多种可逆转EMT的I类HDAC抑制剂和Bromodomain抑制剂。这些数据支持将间充质乳腺肿瘤类器官的形态学筛选作为鉴定逆转EMT药物的平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否基于间充质乳腺肿瘤类器官的形态学特征建立筛选平台，以鉴定逆转EMT的药物并探讨其表观遗传基础。
- 核心机制
- miR-200诱导MET使类器官由尖刺形态转为圆形；筛选获得的I类HDAC抑制剂和Bromodomain抑制剂可逆转EMT，表现为上调E-cadherin（CDH1）转录、降低Zeb1和Slug表达并提高组蛋白H3/H4乙酰化水平，提示HDAC和BRD蛋白是claudin-low细胞EMT状态的共同调控因子。
- 主要证据
- T11和T12类器官经dox诱导miR-200c后形态、Keratin 8、F-actin、Z-cad报告基因及EMT标志蛋白发生改变；基于RESNET-18特征和k-NN的形态学筛选从65种表观遗传药物中鉴定出HDAC和BRD抑制剂；剂量-反应验证及免疫印迹、qPCR证实其逆转EMT；体内MOC联合AZA使T12肿瘤对卡铂增敏并延长荷瘤小鼠生存。
- 研究意义
- 支持将间充质乳腺肿瘤类器官的形态学筛选作为鉴定逆转EMT药物的平台，并可区分EMT重编程效应与直接细胞杀伤，为与标准化疗联合应用提供研究基础，也可扩展至其他药物库和FDA已批准药物的重定位。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建miR-200c诱导及Z-cad报告细胞系
建立可诱导MET的对照体系并实时读取EMT/MET状态
用慢病毒pINDUCER13 miR-200c-141构建T11和T12-TetOn-miR-200c细胞系，用FUGW-d2GFP-ZEB1 3'UTR和pHAGE-E-cadherin-RFP构建T11-TetOn-miR-200c-Z-cad细胞系
三维类器官培养与形态学表型确认
验证间充质肿瘤细胞在三维基质中形成尖刺状类器官，且MET可改变其形态
细胞嵌入Matrigel培养形成类器官，比较vehicle与dox处理组的相差形态、Keratin 8免疫荧光、F-actin染色、Z-cad报告及EMT标志蛋白
优化384孔类器官筛选与图像分析流程
建立可重复、自动化的形态学筛选及分析体系
优化Matrigel浓度与铺板方式，建立含阴性、阳性和毒性对照的384孔筛选板，采集明场z-stack图像，利用预训练RESNET-18特征、PCA和k-NN模型进行分类
表观遗传药物库形态学筛选
鉴定可使间充质类器官形态向MET阳性对照转变的药物
对65种靶向表观遗传修饰因子的化合物在T11和T12类器官中筛选，按阴性、阳性、Media三类分类概率计算AUC并用支持向量回归拟合剂量反应
候选药物剂量-反应验证与活力对照
验证筛选命中并区分EMT重编程与细胞毒性
对排名靠前的阳性对照样药物进行完整剂量-反应检测，计算PR50，并在终点用CellTiter-Glo 3D检测ATP水平
候选药物逆转EMT的分子验证
确认候选药物在蛋白和转录水平逆转EMT并命中靶点
在二维培养的T11和T12细胞中经药物处理后进行免疫印迹和qPCR，检测E-cadherin、Zeb1、Slug、AcH3、AcH4及CDH1-RFP报告活性
体内验证Mocetinostat联合Azacytidine的疗效
评估筛选所得药物在体内逆转EMT并增敏化疗的效果
将T12肿瘤细胞移植至小鼠乳腺脂肪垫，肿瘤可触及后给予AZA、MOC交替2天周期及每周卡铂，检测终点肿瘤EMT标志蛋白并记录生存
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
建立与验证细胞及类器官模型
形态学药物筛选与图像分析
药效与剂量反应分析
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 原代细胞分离 | 胶原酶A | Sigma-Aldrich | 11088793001 |
| 原代细胞筛选 | G418遗传霉素 | Thermo Fisher | 10131035 |
| 支原体检测 | 通用支原体检测试剂盒 | ATCC | 30-1012 K |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Thermo Fisher | 11330032 |
| 胎牛血清 | GenDEPOT | F0900-050 | |
| 胰岛素 | Sigma | I-5500 | |
| 氢化可的松 | Sigma | H0888 | |
| 表皮生长因子 | Sigma | SRP3196 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Thermo Fisher | 15240062 | |
| 细胞系构建 | pINDUCER13 miR-200c-141慢病毒质粒 | Addgene | 81020 |
| FUGW-d2GFP-ZEB1 3'UTR质粒 | Addgene | 79601 | |
| pHAGE-E-cadherin-RFP质粒 | Addgene | 79603 | |
| 类器官培养 | 生长因子减量Matrigel | Corning | 354230 |
| 类器官回收 | 细胞回收液 | Corning | 354253 |
| 组织固定与包埋 | 组织凝胶 | Thermo Fisher | HG-4000-012 |
| 免疫荧光 | 角蛋白8抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 |
| E-cadherin抗体 | BD Biosciences | 610182 | |
| 免疫组织化学 | 泛细胞角蛋白抗体 | Abcam | ab9377 |
| F-actin染色 | Alexa Fluor 488鬼笔环肽 | Thermo Fisher | A12379 |
| DAPI | Thermo Fisher | R37606 | |
| 免疫印迹 | 锆珠 | Benchmark Scientific | D1132-30 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | 23227 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| E-cadherin抗体 | Cell Signaling Technology (CST) | 3195 | |
| Zeb1抗体 | CST | 3396 | |
| GAPDH抗体 | CST | 2118 | |
| Slug抗体 | CST | 9585 | |
| 乙酰化组蛋白H3抗体 | Upstate | 06-599 | |
| 乙酰化组蛋白H4抗体 | Upstate | 06-598 | |
| RNA提取与qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596026 |
| miRNA逆转录 | Taqman microRNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher | 4366596 |
| miRNA qPCR | TaqMan通用预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4440040 |
| mRNA逆转录 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher | 4368814 |
| mRNA qPCR | amfisure qGreen Q-PCR预混液 | GenDEPOT | Q5602 |
| 384孔类器官铺板 | 384孔uClear板 | Greiner | 781091 |
| 活力检测 | CellTiter-Glo 3D活力检测试剂 | Promega | G9682 |
| 体内实验给药 | 阿扎胞苷 | Sigma | A2385 |
| 莫塞替诺他 | LC Laboratories | M2433 | |
| 卡铂 | Sigma | C2538 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类器官培养与形态学表型确认 | Matrigel包被与培养方式、接种细胞数、dox诱导miR-200c浓度（1 μg/ml）、对照设置及独立重复数 阅读提示：Methods中Cell and organoid culture小节及Fig. 1图注 |
| 384孔形态学筛选 | Matrigel浓度与铺板体积、每孔500个细胞、三类对照各16孔、药物处理时间5天及成像方式 阅读提示：Methods中Preparation of 384-well organoid plates小节及Fig. 2a图注 |
| 图像分析与k-NN建模 | RESNET-18特征提取、PCA与k-NN参数（6个最近邻）、对照50/50训练/测试划分及模型准确率评价 阅读提示：Methods中Image acquisition and analysis小节及Fig. 2b图注 |
| 表观遗传药物库筛选 | 65种化合物的来源、四个筛选浓度、两个独立生物学重复、Pin tool转移体积（100 nl）及AUC计算方法 阅读提示：Methods中Drug addition for screening and validation assays小节及Fig. 3图注 |
| 候选药物剂量-反应验证 | 10个浓度半对数梯度、技术四重复、PR50定义及细胞活力对照检测终点 阅读提示：Fig. 4图注及Supplementary Fig. 5 |
| 候选药物分子验证 | 二维细胞处理时间、T11与T12中Fimepinostat浓度差异（200 nM与20 nM）、其余药物1 μM、独立生物学重复三次 阅读提示：Fig. 5图注 |
| 体内移植与治疗 | 细胞接种量、小鼠品系与周龄、给药起始时间、各药物剂量与给药途径、每组n=5及伦理终点 阅读提示：Methods中Tumor transplantation and treatment小节及Fig. 6a图注 |